天然酿酒酵母菌株的细胞表面分子工程改造及其在生物技术领域的前沿应用

为解决天然酿酒酵母菌株难以应用于基于表面展示（SD）技术的问题，意大利帕多瓦大学的研究人员开展相关研究。结果表明构建的质粒可驱动蛋白在其表面表达，提升金属吸附性能。这为生物技术应用提供新方向，值得科研人员一读。

　　

意大利帕多瓦大学（University of Padova）生物医学科学系的 Sara Granuzzo 等人在《Biology Direct》期刊上发表了题为 “Functional improvement of natural Saccharomyces cerevisiae yeast strains by cell surface molecular engineering” 的论文。这篇论文在生物技术领域意义重大，为利用天然酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株进行生物修复（bioremediation，利用生物的生命代谢活动减少污染环境中有毒有害物的浓度或使其无害化的过程 ）和酶固定化等应用开辟了新的道路。

研究背景

“表面展示”（Surface Display，SD）技术是一种基因工程手段，它能让细胞将特定的目标蛋白展示在细胞外表面，并使其与细胞壁稳定结合。酿酒酵母作为一种广泛应用于食品制备（如面包、葡萄酒、啤酒制作）和生物技术（如生物乙醇和药品生产，像胰岛素）领域的微生物，被归类为 GRAS（Generally Recognized as Safe，一般认为安全）生物，具有生长速度快、营养需求低等优点。将 SD 技术应用于酿酒酵母，有望开发出众多可持续的应用，比如作为特定生物催化剂的固定化平台，或者作为生物制剂用于重金属去污。

通常，在酵母细胞表面表达的蛋白需要包含分泌信号和细胞壁锚定结构域这两个特定结构元件。分泌信号引导蛋白通过分泌途径运输，而细胞壁锚定结构域则使蛋白与酵母细胞壁结合。然而，目前 SD 技术在酿酒酵母中的应用仅局限于实验室菌株，这些菌株只是一小部分经过驯化的群体，具有便于研究的特性。相比之下，从自然环境中分离出的酿酒酵母菌株，如用于葡萄酒和啤酒工业生产的菌株，经下一代测序（NGS，Next-Generation Sequencing）发现具有高度的基因组变异性，独特的等位基因组合可能赋予它们特殊的表型特征。但此前没有研究探索过将天然酿酒酵母菌株用于基于 SD 技术的应用，主要原因是缺乏合适的分子工具（如用于蛋白质表达的质粒或 CRISPR/Cas9 基因组编辑工具），以及在操作天然酵母细胞时面临诸多挑战（如选择标记和转化方案等问题）。因此，开展这项研究旨在填补这一空白，开发能在天然酿酒酵母菌株中支持 SD 策略的新分子工具，为整个研究领域提供帮助。

研究方法

1. 菌株和培养基：研究中使用的酵母（酿酒酵母）和细菌（大肠杆菌）菌株信息在补充材料和表格 ST1 中详细说明。酵母菌株在标准完全培养基（YPD）或合成 SD 培养基中培养，根据实验需求添加抗生素或氨基酸。大肠杆菌在 LB 培养基中培养，必要时添加氨苄青霉素。培养基成分和化学试剂购自 Difco、Sigma-Aldrich 和 Jena Bioscience GmbH 等公司。
2. 质粒构建：实验所用的酵母表面展示（YSD，Yeast Surface Display）质粒均由多拷贝、半乳糖诱导型 pYES2 载体改造而来。通过 InFusion-HD 克隆试剂盒，依次将 α - 因子分泌信号序列（MFα1）、FLAG 标签、不同多肽（yCup1、GFP、exa-Histidine）的编码序列以及细胞壁锚定结构域（SAG1）的序列插入到 pYES2 载体中，构建出 pGAL-YSD 系列质粒。之后，用组成型酿酒酵母 TDH3 基因的启动子替换半乳糖诱导型 GAL1 启动子，得到 pGAP-YSD 系列质粒。最后，将部分质粒中的 URA3 营养标记替换为 NatR 标记，获得 pYSD 系列质粒。此外，还构建了用于 CRISPR/Cas9 酵母基因组修饰的质粒 gADEpMEL13-Cas9。所有重组质粒都经过 DNA 限制性分析和 Sanger 测序进行严格验证 。
3. 酵母操作：酿酒酵母细胞采用醋酸锂法进行化学转化，重组克隆在缺乏尿嘧啶的合成 SD 培养基或添加抗生素的完全 YPD 培养基上筛选和分离。CRISPR/Cas9 基因修饰按照先前描述的方法进行，酵母细胞与 gRNA/Cas9 表达质粒和供体 dsDNA 片段共转化，通过位点特异性 PCR 检测确认基因修饰情况 。
4. 酵母蛋白质提取和蛋白质免疫印迹分析：采用三氯乙酸（TCA）法提取酵母细胞中的总蛋白质，经过 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗 FLAG 或抗 GAPDH 抗体进行免疫印迹检测，最后通过增强化学发光试剂试剂盒和 UVItec 成像系统进行显色和数字化处理。
5. 免疫细胞化学和共聚焦显微镜观察：将在 YPD 培养基中过夜培养的酵母细胞用甲醛固定，DAPI 染色细胞核 DNA，然后依次与抗 FLAG 一抗和 Alexa Fluor 555 标记的二抗孵育，最后用共聚焦显微镜观察，成像后用 Fiji/ImageJ 软件处理图像。
6. 金属吸附实验和电感耦合等离子体发射光谱分析（ICP-OES）：酵母细胞在含有金属离子（铜离子或镍离子）的培养基中孵育进行金属吸附，之后用 EDTA 解离金属离子，通过 ICP-OES 测定上清液中金属离子的浓度，从而评估酵母细胞对金属离子的吸附能力。
7. 统计分析：使用 Prism 8 和 Microsoft Excel 软件对实验数据进行分析，数据以平均值 ± 标准误差（SEM）表示，通过设定不同的统计检验方法，当 p 值小于 0.05 时认为具有统计学意义 。

研究结果

1. 用于酵母细胞表面蛋白质表达的质粒构建：研究人员选择了酿酒酵母胞质金属硫蛋白（yCup1p）、异源荧光蛋白 mNeonGreen（以 GFP 表示）和小肽 exa-Histidine（6xHis）作为模型多肽，构建了 pGAL-YSD 系列质粒。在实验室菌株 CENPK 中，这些质粒能在半乳糖诱导下成功表达融合蛋白，且蛋白表达呈时间和半乳糖浓度依赖性。将 GAL1 启动子替换为组成型 GAP 启动子后得到的 pGAP-YSD 系列质粒，同样能在 CENPK 细胞中组成型表达融合蛋白。免疫荧光分析表明，这些融合蛋白能正确定位到酵母细胞表面。此外，表达 yCup1 的酵母细胞在含铜培养基中生长时，表现出对铜毒性的抗性，而表达 GFP 的酵母细胞可直接观察到绿色荧光，证实了这些蛋白在细胞表面保持了功能活性 。
2. 在天然菌株中对酵母表面展示（YSD）质粒的分析：为了在天然酵母菌株中评估 YSD 质粒驱动的蛋白质表达，研究人员将 pYES2 衍生载体中的 URA3 营养标记替换为 NatR 显性标记，构建了 pYSD-yCup1 和 pYSD-6xHis 质粒。用 pYSD-yCup1 质粒转化多个天然酿酒酵母菌株后，蛋白质免疫印迹分析显示所有菌株都表达了 FLAG 标记的 yCup1 融合蛋白，但表达水平存在差异。选择了三个表达水平相近但表型不同的菌株（IB1、IB2 和 IB3），用 pYSD-6xHis 质粒转化后，证实了 exa-Histidine 融合蛋白也能在这些天然菌株的细胞表面成功表达和定位。这表明 pYSD 质粒在不同遗传背景的酵母菌株中都能有效驱动蛋白质表达，具有通用性 。
3. 表面表达嵌合蛋白的酵母细胞的金属结合能力：通过 ICP-OES 实验评估表达 yCup1 或 exa-Histidine 融合蛋白的酵母细胞对铜离子和镍离子的结合能力。结果显示，与未转化的亲本菌株相比，表达 exa-Histidine 的酵母细胞显著增加了对镍离子的结合，且在两个天然菌株（IB1 和 IB3）中这种增加超过十倍，镍离子结合呈现剂量依赖性。表达 yCup1 的酵母细胞对铜离子的结合也显著增强，不过不同菌株的基础铜离子结合能力存在差异，且铜离子结合能力与菌株对金属毒性的敏感性似乎无关，可能受菌株内在硫化氢产生能力的影响 。
4. 利用 CRISPR/Cas9 系统对天然酵母菌株进行基因修饰：为了克服质粒拷贝数导致的蛋白质表达水平克隆变异性问题，研究人员利用 CRISPR/Cas9 系统将 YSD-yCup1 表达盒稳定整合到两个天然酵母菌株（IB1 和 IB2）的基因组 ADE2 位点。免疫荧光分析证实了 yCup1 融合蛋白的表达和表面定位，ICP-OES 分析表明基因修饰后的菌株铜离子结合能力显著增强，与携带多拷贝 pYSD-yCup1 质粒的菌株相当。此外，构建了表达含有三个金属硫蛋白串联重复序列的 pYSD-3x-yCup1 质粒，转化天然 IB1 酵母菌株并将其基因整合到基因组后，发现表达 3x-yCup1 蛋白的菌株铜离子结合能力进一步提高，无论是质粒转化的细胞还是基因组整合的菌株，与未修饰的 IB1 菌株相比，铜离子结合能力分别提高了约 4 倍和 6 倍 。

研究结论与讨论

这项研究成功开发了能在天然酿酒酵母菌株中支持 YSD 系统的新型分子工具。实验数据表明，这些质粒能在多种酵母菌株的细胞外表面有效驱动嵌合蛋白的表达，几乎适用于所有从自然环境中分离的酿酒酵母菌株的改造。通过在酵母细胞表面展示金属结合蛋白，显著提高了天然酵母菌株的金属吸附性能，这为生物修复提供了潜在的应用方向，拓宽了酵母菌株在金属去除领域的应用范围。此前酵母菌株多应用于酿酒等领域，很少用于金属去除，而现在这些经过改造的天然酵母菌株为解决重金属污染问题提供了新的途径。

不过，目前仍有一些问题有待进一步研究。比如，需要深入探究金属亲和力、结合特异性，以及 YSD 修饰菌株在复杂环境（如受污染的废水）中的性能，因为在这些环境中多种金属离子可能会竞争结合位点。此外，研究其他形式（如死细胞或细胞碎片）的应用也可能带来新的发现，有研究表明死细胞在金属结合效率、耐 pH 变化和抗离子浓度变化方面可能具有优势。将 YSD 表达盒整合到酵母基因组中具有重要意义，这样的细胞可以在标准培养基中生长，无需使用抗生素，既降低了成本，又避免了长期使用抗生素导致的耐药性问题，有利于大规模工业生产。虽然目前 YSD 修饰菌株作为转基因生物在部分国家（如欧盟）的使用受到限制，但在其他国家（如美国），其应用有助于葡萄酒等行业解决葡萄汁中高浓度铜影响发酵过程的问题。未来，随着研究的不断深入，这些经过表面工程改造的酵母菌株有望在生物催化等多个领域展现出更广阔的应用前景，为生物技术的发展带来新的突破 。