用猫抗苗勒管激素类似物基因治疗：母猫生育调控新突破与挑战

为解决流浪猫数量过多问题，澳大利亚莫纳什大学研究人员开展猫抗苗勒管激素（AMH）基因治疗研究。结果显示，该治疗可破坏母猫卵泡生成、致妊娠失败。这为控制流浪猫生育提供新思路，极具科研价值，推荐阅读。

　　

澳大利亚莫纳什大学（Monash University）的威廉?A?斯托克（William A. Stocker）等研究人员在《自然通讯》（Nature Communications）期刊上发表了题为 “用猫抗苗勒管激素类似物进行基因治疗可破坏母猫卵泡生成并导致妊娠失败”（“Gene therapy with feline anti-Müllerian hormone analogs disrupts folliculogenesis and induces pregnancy loss in female domestic cats”）的论文。这篇论文在动物生育控制领域具有重要意义，为解决流浪猫数量过多的问题提供了新的思路和潜在方法。

研究背景

全球有数以亿计的流浪猫，对生态环境造成了巨大压力，控制流浪猫数量迫在眉睫。目前，母猫绝育的唯一方法是卵巢子宫切除术，但这种方法存在局限性，需要寻找替代的避孕方法。抗苗勒管激素（Anti-Müllerian hormone，AMH），也被称为苗勒管抑制物质（Müllerian inhibiting substance，MIS），由生长中的卵泡颗粒细胞产生，在卵巢内作为自分泌 / 旁分泌因子，以复杂且可能具有物种特异性的方式影响卵泡的生长和存活 。在小鼠研究中发现，AMH 可减少原始卵泡的激活及其向初级卵泡的转化，这使得 AMH 成为一种潜在的避孕候选物质。此前已有研究尝试用 AMH 进行基因治疗以实现避孕效果，如在小鼠中，用 AMH 进行基因治疗可减少初级卵泡数量，几乎完全阻止卵泡发育到次级阶段，导致小鼠不育 。在猫的研究中，也有研究人员通过腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）将表达猫 AMH（feline AMH，fAMH）的载体注入母猫体内，发现高生理水平的 AMH 在猫身上的作用机制与小鼠不同，可抑制诱导排卵，从而实现持久避孕 。然而，不同研究中 AMH 的避孕机制存在差异，令人困惑，且现有研究仍有许多未知之处，这促使研究人员开展进一步研究。

研究方法

1. 构建猫 AMH 变体表达构建体：研究人员对猫 AMH（GenBank ID：XP_011286375.2）的氨基酸序列进行密码子优化并合成，然后克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1 (+) 中。通过定点突变技术，使用定制的诱变引物，对猫 AMH 表达构建体进行突变，引入 A477K/Q478K 和 G561S 突变，分别构建出 fAMH_RKKR 和 fAMH_RKKR/G561S 变体。
2. 在 HEK293T 细胞中瞬时表达猫 AMH 变体：将 HEK293T 细胞接种在 12 孔板中，过夜培养后，将含有猫 AMH 变体的质粒 DNA 与聚乙烯亚胺（PEI）-MAX 混合，转染到细胞中。在 OPTI-MEM 培养基中培养一段时间后，收集含有分泌的猫 AMH 变体的条件培养基，离心后储存于 - 20°C。
3. 评估猫 AMH 变体的体外加工和活性：通过 Western blot 分析条件培养基中猫 AMH 变体前体的切割效率和成熟 AMH 的分泌量，以重组人 AMH 作为阳性对照和标准品。利用基于细胞的荧光素酶报告基因检测法，评估猫 AMH 变体的活性。将含有 SMAD1/5/9 响应性转录报告基因和 AMH 受体的质粒转染到 HEK293T 细胞中，用稀释后的条件培养基处理细胞，测量荧光素酶活性，以评估 AMH 变体的活性。
4. AAV 载体生产：将编码 fAMH 类似物的密码子优化的转基因克隆到含有杂交巨细胞病毒增强子 / 鸡 β - 肌动蛋白启动子的表达载体中，两侧为 AAV 的 5' 和 3' 反向末端重复序列（ITR），并包装在 AAV Clade A rh91 衣壳（AAVrh91）载体中，通过三重转染辅助质粒和转移质粒进行生产，随后通过碘克沙醇梯度纯化，并通过 Taqman 定量 PCR 进行滴定。
5. AAV 载体将 fAMH 类似物递送至猫体内：选取 18 只育龄母猫，随机分为三组，每组 6 只。在给予 AAV - fAMH 载体前，对猫进行 14 天的监测。在第 14 天，对三组猫分别进行单次肌肉注射，剂量为 1×1013 基因组拷贝（GC，0.5 ml）的 AAV 空载体、AAV - fAMH_RKKR 或 AAV - fAMH_RKKR/G561S。在整个研究过程中，每天至少进行一次一般健康观察，在给药后 2 - 4 小时及第 1 - 3 天进行注射部位观察。
6. 血清收集和激素测量：从猫的颈静脉或头静脉采集 1 - 2 ml 血液，待血液凝固后离心，收集血清用于激素和转基因表达分析。在研究的第 0 天至第 126 天，每隔 2 - 3 天测量血清中的孕酮和雌二醇水平。每周使用犬 / 猫 AMH ELISA 试剂盒测量血清中 fAMH 类似物的表达。同时，使用猫促黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）ELISA 试剂盒测量血清 LH 浓度。
7. 评估猫 AMH 类似物的体内加工和活性：通过 Western blot 分析血清中循环的猫 AMH 变体的加工效率，用基于 HEK293T 细胞的荧光素酶报告基因检测法评估其活性。将不同时间点收集的血清稀释后处理转染了报告基因和受体的 HEK293T 细胞，测量荧光素酶活性。
8. 繁殖试验：在第 197 天，将猫随机重新分配到三个新组中，每组引入一只雄性猫。在 12 周的时间内，雄性猫至少每 2 周在各组间轮换一次。从引入雄性猫 2 周后开始，每周通过超声和触诊评估雌性猫是否怀孕，在雄性猫移除后 5 - 6 周进行最后一次怀孕评估。
9. 组织学分析：在研究结束时，在母猫的小猫断奶后，对每只猫在全身麻醉下切除一个卵巢。对卵巢标本进行常规处理，制成 3 - 5 微米的切片，用苏木精和伊红染色，由兽医病理学家 / 动物繁殖学家进行显微镜评估，对卵泡、黄体、闭锁卵泡和卵巢囊肿等结构进行量化。

研究结果

1. 诱变增强猫 AMH 的加工和活性：野生型 fAMH 加工效率低，信号活性也低。通过对 fAMH 的 AMHR2 结合位点（G561S）和 / 或前蛋白转化酶切割位点（A477K/Q478K）进行修饰，构建出 fAMH_RKKR 和 fAMH_RKKR/G561S 变体。在 HEK293T 细胞中表达这些变体后，Western blot 分析显示，fAMH_RKKR 变体增强了前体的切割和成熟 fAMH 的积累，G561S 点突变未影响这种增强的加工效率。荧光素酶报告基因检测结果表明，fAMH_RKKR 诱导的荧光素酶反应比 fAMH 高约 4 倍，fAMH_RKKR/G561S 的活性比 fAMH_RKKR 又提高了 1.5 倍，这表明这些变体可能是有效的母猫避孕剂。
2. 基因治疗导致猫 AMH 的持续分泌：18 只母猫随机分为三组，分别接受 AAV 空载体、AAV - fAMH_RKKR 或 AAV - fAMH_RKKR/G561S 注射。在注射后的 12 只治疗猫中，有 11 只循环 AMH 迅速增加，在三周内达到比对照组高约 7000 倍的水平，且在 280 天的研究期间一直维持高水平，这表明 AAVrh91 载体将生长因子成功递送至骨骼肌并实现了稳定的转基因表达 。Western blot 分析血清发现，在注射 AAV - fAMH_RKKR 或 AAV - fAMH_RKKR/G561S 后，成熟 fAMH 在血清中可被检测到，且未检测到未加工的 fAMH 前体，说明体内切割效率更高。荧光素酶报告基因检测显示，注射后血清可诱导报告基因活性增加，表明循环中的 fAMH_RKKR 和 fAMH_RKKR/G561S 持续加工为成熟 / 活性形式。
3. 长期超生理水平的 AMH 影响雌二醇分泌：测量血清中孕酮和雌二醇水平，以评估高活性 AMH 类似物对猫卵巢周期的影响。在研究的前 126 天，部分猫表现出正常的发情周期，部分猫出现重复自发排卵。在激素测量的最后 36 天，一些高循环 AMH 的猫，尤其是 fAMH_RKKR/G561S 组的猫，雌二醇分泌和发情周期出现异常，雌二醇水平持续处于基线或接近基线水平。同时，这些猫的 LH 水平在第 126 天显著高于正常周期的猫，这表明高循环水平的 AMH 可能导致窦状卵泡数量下降，进而影响雌二醇的产生和发情周期。
4. 超生理水平的 AMH 破坏猫的妊娠：在第 197 天开始 12 周的繁殖试验，雄性猫在各组间轮换。对照组 6 只母猫均怀孕，除 1 只母猫外，其余均产下健康小猫。在 fAMH_RKKR 和 fAMH_RKKR/G561S 组，分别有 3/5 和 5/6 的母猫怀孕，但所有高循环 AMH 类似物的怀孕母猫均未分娩。超声和体格检查表明，这些母猫的妊娠失败与胎儿吸收有关，而非流产。根据猫的妊娠期和超声检查结果推测，高 AMH 水平可能在妊娠 6 - 7 周左右破坏妊娠的维持。
5. 高表达 AMH 的猫卵泡生成受到破坏：研究结束时，对猫的卵巢进行组织学评估。结果显示，对照组、fAMH_RKKR 组和 fAMH_RKKR/G561S 组的原始卵泡、初级 / 次级卵泡和窦前卵泡数量没有差异，但对照组的小窦状卵泡数量显著多于高循环 AMH 的猫组，大窦状卵泡数量在对照组也有更高的趋势。此外，高血清 AMH 水平的猫卵巢中出现非卵泡性卵巢囊肿的比例较高，部分猫还出现了囊性黄体和退化的黄体，这些发现表明高活性 AMH 对猫卵巢有多种影响，可能直接或间接阻止妊娠的维持。

研究结论与讨论

研究人员通过构建并向母猫体内递送猫 AMH 类似物，发现这些类似物可在体内持续产生超生理水平的活性 AMH，对母猫的卵巢功能和妊娠产生显著影响。高活性 AMH 虽不影响原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的数量，但会导致窦状卵泡数量逐渐减少，进而影响雌二醇的分泌和发情周期。尽管如此，大多数高循环 AMH 的猫仍能排卵，且部分怀孕，但均无法维持妊娠，出现胎儿吸收现象。

与之前的研究相比，本研究中 AMH 的作用机制有所不同。之前研究认为高 AMH 水平可抑制猫的窦状卵泡成熟和排卵，从而实现避孕；而本研究表明，AMH 主要是减少窦状卵泡池，并不抑制排卵和受孕，妊娠失败是由于中晚期胎儿吸收 。这种差异可能与 AMH 形式（本研究中使用的 AMH 类似物加工更好、活性更强）以及繁殖试验的时间和次数不同有关。

本研究为猫的生育控制提供了重要信息，但仍有许多问题需要进一步研究。例如，应在 AAV：fAMH 递送后更早、更频繁地进行繁殖试验，以确定升高的 AMH 多快能破坏妊娠维持并实现避孕效果；收集更多治疗前后包括繁殖试验期间的血清，以明确下丘脑 - 垂体 - 卵巢功能是如何被破坏导致妊娠失败的；对不同时间点的卵巢进行组织学、免疫组化和 RNA 测序，有助于深入了解卵巢功能的进行性下降和卵巢囊肿的形成机制；评估胎盘功能，确定其是否是 AMH 过表达导致猫妊娠失败的因素之一。

总之，这项研究确认了 AMH 作为控制流浪猫生育的候选物质的潜力，但要将其发展为有效的避孕方法，还需要更多深入研究。这不仅有助于解决流浪猫数量过多带来的生态问题，也为动物生育控制领域的研究提供了有价值的参考，推动相关技术的进一步发展。