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为解决蛋白质共翻译折叠难题，VIB-KU Leuven 中心的研究人员开展 “Native Fold Delay” 相关研究。他们发现 NFD 与分子伴侣结合、蛋白聚集有关。该研究为理解蛋白折叠机制提供新视角，强烈推荐科研读者阅读。
来自 VIB-KU Leuven 中心大脑与疾病研究中心（VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research）的 Ramon Duran-Roma?a、Bert Houben 等研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Native Fold Delay and its implications for co-translational chaperone binding and protein aggregation” 的论文。这篇论文在蛋白质折叠研究领域意义重大，为深入理解蛋白质共翻译折叠过程、分子伴侣的作用机制以及蛋白质聚集相关疾病的发病机理提供了新的视角和理论依据，有望推动相关领域的进一步发展。
论文摘要指出，由于蛋白质翻译的方向性，在天然蛋白质结构中相互作用但在一级序列中相距较远的残基不能同时出现，会存在时间延迟，可能导致非天然相互作用。研究人员引入 “天然折叠延迟”（Native Fold Delay，NFD）这一指标，将蛋白质拓扑结构与翻译动力学相结合来量化这种延迟。研究发现许多蛋白质存在 NFD 值在数十秒范围内的残基，这些残基多位于结构有序、埋藏区域，且常与聚集倾向区域重合。NFD 与酵母 Hsp70 分子伴侣 Ssb 的共翻译结合相关，表明天然折叠延迟区域易发生错误折叠。研究还显示，NFD 值长的蛋白质更易共翻译泛素化，在 Ssb 缺失时更易聚集。
在蛋白质折叠研究领域，传统体外实验虽揭示了蛋白质折叠的一些基本原理，如蛋白质一级氨基酸序列编码其天然折叠构象的信息，但仍有大量蛋白质在体外无法从变性状态重新折叠，常发生错误折叠和聚集，尤其是那些大的、多聚体且拓扑结构复杂的蛋白质，即便添加分子伴侣也难以解决。
体内蛋白质合成过程中，翻译与折叠紧密相关。蛋白质翻译速度在原核生物中约为每秒 20 个氨基酸，在真核生物中约为每秒 5 个氨基酸，而蛋白质二级和三级结构的折叠速度通常在微秒到秒的范围内，远快于翻译速度。因此，体内局部折叠事件往往在多肽链从核糖体中延伸出来的同时就已开始，即共翻译折叠。研究表明，大肠杆菌胞质蛋白质组中约三分之一的蛋白质至少有一个结构域是共翻译折叠的，在真核生物中这一比例可能更高。同时，密码子使用（常作为翻译速率的指标）也会影响共翻译折叠途径。然而，共翻译折叠也存在问题，翻译的方向性会导致需要长程天然相互作用的折叠事件出现时间延迟，可能引发非天然相互作用，导致错误折叠和聚集。为避免这种情况，细胞内存在一系列机制，如核糖体自身的 holdase 功能以及多种分子伴侣参与共翻译过程，但仍有大量新合成的多肽会因翻译错误或无法形成天然折叠而被蛋白酶体降解。基于此，开展该研究以深入探究共翻译折叠过程中易发生错误折叠的区域及相关机制十分必要。
研究人员采用了多种先进的关键技术方法。在计算 NFD 时，基于蛋白质结构，通过计算每个残基与其最远的 C 末端相互作用残基之间的序列距离（以氨基酸残基数量表示），并结合翻译延伸速率，将其转换为时间单位，从而量化每个残基的天然折叠延迟时间。利用 AlphaFold 预测的蛋白质结构和计算相对便宜的 NFD 算法，研究人员得以在全蛋白质组范围内计算 NFD 值。同时，借助预测对齐误差（Predicted Aligned Error，PAE）这一指标，筛选掉预测结构中相对位置不可靠的残基间相互作用，提高了研究的准确性。对于分子伴侣 Ssb 的研究，研究人员使用了选择性核糖体分析（selective ribosome profiling，SeRP）获得的 Ssb 结合足迹数据集，通过对这些数据进行元基因分析，探究 Ssb 与新生链结合区域的 NFD 特征。此外，还运用了计算工具 Limbo 预测分子伴侣结合位点，并通过肽阵列实验验证 Ssb 与不同区域的结合情况。
蛋白质翻译与折叠时间尺度差异
研究人员从蛋白质折叠数据库（Protein Folding DataBase，PFDB）中获取 133 种单结构域球状蛋白质的折叠速率，结合蛋白质长度和不同生物的平均翻译速率，估算出翻译时间。结果显示，蛋白质翻译时间通常在秒的量级，而折叠时间从微秒到秒不等，在 133 个案例中有 126 个（95%）蛋白质的体外重折叠时间短于其翻译完成所需时间。这表明对于大多数蛋白质来说，折叠是一个共翻译过程，在蛋白质 N 端从核糖体隧道出现后不久就开始了。
向量蛋白翻译对折叠的时空限制及 NFD 指标
受接触顺序（Contact Order，CO）概念启发，研究人员提出 NFD 指标。以大肠杆菌肽基脯氨酰异构酶 B（PPIase B）为例，其 N 端的 β - 折叠链 E1 需要等待 C 端的 E8 合成后才能形成完整的天然相互作用，导致 E1 有较长的 NFD 值，而 E8 的 NFD 值可忽略不计。通过对 SCOPe40 数据集中蛋白质结构域的 NFD 分析发现，NFD 具有明显的 N 端到 C 端梯度，N 端元件通常比 C 端元件具有更大的 NFD 值；结构域长度和拓扑结构也会影响 NFD，较长的多肽链和更复杂的拓扑结构往往具有更大的 NFD 值。此外，不同生物的翻译速率差异会导致相似折叠结构域的 NFD 值有很大不同，如酿酒酵母中的一种肽基脯氨酰顺反异构酶与大肠杆菌的 PPIase B 结构相似，但由于酿酒酵母翻译速率较慢，其 N 端链的 NFD 值对应的等待时间更长。
序列中长 NFD 片段的特征
在全蛋白质组范围内计算 NFD 发现，大多数蛋白质至少有一个残基需要等待数十秒才能与所有天然相互作用残基完成相互作用。特定二级结构更易产生 NFD，如 β - 折叠结构元件富含 NFD 值长的残基，而随机卷曲和螺旋结构的 NFD 值相对较短。长 NFD 区域在序列组成上富含芳香族和脂肪族氨基酸，这些区域通常结构有序、埋藏在蛋白质内部，对天然结构的热力学稳定性很重要，且与聚集倾向区域（aggregation - prone regions，APRs）的比例随 NFD 值增加而显著提高。
Ssb 结合位点的 NFD 特征
通过对 Ssb 结合足迹的元基因分析，研究人员发现 Ssb 结合区域的 NFD 值在 N 端约 50 个氨基酸处出现明显峰值，该峰值位置与之前报道的 Ssb 结合位点和足迹的距离相符，且该区域具有 Ssb 结合基序的特征。与接触顺序（CO）分析结果对比，CO 无法显示 Ssb 结合的特异性，而 NFD 能很好地解释 Ssb 优先结合长 NFD 区域的现象。研究还发现，预测的 Ssb 结合位点中，体内未结合 Ssb 的区域 NFD 值较短，且 Ssb 结合区域的 NFD 值与结合时间相关，足迹越宽（结合时间越长），NFD 值越大。这表明氨基酸组成和未满足的天然相互作用（由 NFD 体现）共同决定了 Ssb 的共翻译结合。
长 NFD 蛋白质与共翻译错误折叠和聚集的关系
利用 Willmund 等人的数据集分析发现，Ssb 的底物蛋白通常具有较大的总 NFD 值，且在 Ssb 缺失时发生聚集的底物蛋白总 NFD 值更大。通过逻辑回归分析表明，长 NFD 的蛋白质在 Ssb 缺失时更易聚集，且聚集蛋白的 Ssb 结合区域中 APRs 的比例显著高于未聚集蛋白。对 Jacobson 等人的数据集分析发现，在三价砷（III）处理导致蛋白质聚集的情况下，聚集蛋白的总 NFD 值也显著更大。此外，对 Duttler 等人的数据集重新分析显示，共翻译泛素化的蛋白质总 NFD 值明显大于未泛素化的蛋白质，且长 NFD 的蛋白质更易共翻译泛素化。这些结果表明，长 NFD 的蛋白质在共翻译过程中更易发生错误折叠和聚集，尤其是在蛋白毒性应激条件下。
研究人员引入的 NFD 指标有效量化了蛋白质翻译过程中天然相互作用残基出现的时间延迟，为研究共翻译折叠提供了重要的量化工具。研究发现长 NFD 区域在蛋白质中较为常见，这些区域易发生非天然相互作用，是共翻译折叠过程中的脆弱区域。Ssb 等分子伴侣优先结合长 NFD 区域，说明 NFD 可作为分子伴侣识别易错误折叠区域的重要参数，这一发现完善了对分子伴侣作用机制的理解。同时，研究揭示了长 NFD 的蛋白质与共翻译错误折叠、聚集以及泛素化之间的紧密联系，明确了蛋白质在共翻译过程中面临的折叠挑战以及细胞内应对这些挑战的部分机制。
该研究的意义在于，为蛋白质折叠领域的研究提供了新的思路和方法，有助于深入理解蛋白质共翻译折叠的复杂过程，为后续研究蛋白质错误折叠相关疾病（如神经退行性疾病等，许多这类疾病与蛋白质聚集密切相关）的发病机制奠定了基础。通过对 NFD 的研究，未来有望开发出针对蛋白质错误折叠和聚集的干预策略，如设计更有效的分子伴侣模拟物或调控翻译过程来减少蛋白质错误折叠，从而为相关疾病的治疗和预防提供新的方向。但该研究也存在一定局限性，NFD 仅计算每个残基与其最远相互作用残基的时间延迟，可能会高估某些残基的潜在风险，未来研究可进一步优化该指标，更准确地评估蛋白质折叠过程中的风险区域。
