核苷酸诱导的转录终止因子p超寡聚化失活机制及其在细菌应激响应中的作用

本研究揭示了细菌转录终止因子p在应激条件下的新型调控机制。研究人员通过冷冻电镜、生化和遗传学方法，发现ADP和(p)ppGpp通过结合p蛋白的核苷酸结合位点，诱导形成非活性的超寡聚体结构。该研究阐明了p蛋白在翻译抑制和应激条件下通过寡聚化实现自我抑制的分子机制，为理解细菌基因表达调控提供了新视角。

　　

在细菌生存的严酷环境中，基因表达的精确调控至关重要。转录终止因子p作为基因组"哨兵"，负责终止受损和无用RNA的合成，但其在休眠或应激状态下的调控机制长期未明。当翻译效率低下时，p的过度活化可能导致重要转录本被错误终止，这对细菌适应环境变化构成了重大挑战。

俄亥俄州立大学（The Ohio State University）与柏林自由大学（Freie Universit?t Berlin）的研究团队通过多学科方法揭示了这一关键调控机制。研究发现，应激相关核苷酸ADP和(p)ppGpp通过结合p蛋白的CTD结构域（C-terminal domain）核苷酸结合位点，触发非活性p寡聚体的形成。这一发现发表于《Nature Communications》，为理解细菌在营养限制条件下的生存策略提供了新见解。

研究采用了冷冻电镜（cryo-EM）解析p蛋白寡聚体结构，结合体外交联实验和体内沉降分析，证实了核苷酸依赖性寡聚化的动态特性。通过构建p蛋白连接区突变体（G150D和G152D），研究人员利用遗传学方法验证了寡聚化与终止功能的关系。

结果

p连接区突变体形成细丝

研究发现，p蛋白连接区的G150D和G152D突变导致其自发形成延伸的螺旋细丝。冷冻电镜结构显示，这些细丝由18个p原体组成，呈现左手螺旋构象。与野生型相比，突变体细丝的螺旋螺距增加，导致环开口扩大，促进额外六聚体的加入。

野生型p在体外和体内形成寡聚体

沉降实验证明ADP显著促进野生型p的聚集。通过设计半胱氨酸"传感器"（C84/C405和C106/C375）和使用双马来酰亚胺乙烷（BMOE）交联剂，研究人员证实p在ADP存在下形成细丝。体内实验显示，G150D突变体在细胞中主要形成高级寡聚体，而野生型p则以六聚体为主。

ADP稳定p蛋白开环构象

结构分析发现，ADP通过稳定R353-W381阳离子-π相互作用维持p的开环构象。这种构象抑制了p的ATP酶活性和终止功能，揭示了能量应激状态下p活性调控的结构基础。

G150D突变促进体内超寡聚化

蔗糖密度梯度分析证实，G150D突变体在细胞内形成高级寡聚体。该突变体对(p)ppGpp合成酶RelA的表达异常敏感，表明核苷酸信号与p寡聚化存在功能关联。

应激条件下野生型p的寡聚化

抗生素处理实验显示，抑制蛋白质或RNA合成的药物（如莫匹罗星、瑞他帕林和利福平）可诱导p聚集。这一过程依赖于(p)ppGpp，且在去除应激条件后可逆，表明p寡聚化是细菌应对短期应激的适应性反应。

(p)ppGpp结合ATPase位点诱导p寡聚化

研究发现ppGpp和pppGpp促进p形成十二聚体而非细丝。冷冻电镜结构显示pppGpp结合于p的ATP结合口袋，通过改变原体间相互作用网络诱导特定寡聚状态。与ADP稳定的细丝不同，ppGpp诱导的寡聚体对ATPyS敏感，显示其动态特性。

ADP和(p)ppGpp通过改变p原体界面促进超寡聚化

详细的结构比较揭示，不同核苷酸通过特异性相互作用网络改变原体间接触，从而产生几何差异的六聚体，进而形成不同高级寡聚体。

该研究阐明了p蛋白活性调控的双重机制：通过连接区构象变化实现结构性调控，以及通过核苷酸结合实现代谢状态感知。发现p的应激依赖性寡聚化代表了一种保守的酶活性调控策略，与核糖体休眠等过程共同构成细菌的应激响应网络。研究不仅深化了对转录终止机制的理解，也为开发新型抗菌药物提供了潜在靶点。p蛋白在不同细菌中呈现的相变多样性（从液-液相分离到淀粉样聚集）暗示了其在进化过程中的适应性分化，这一发现将对原核基因调控研究产生深远影响。