长链 RNA 测序揭示溃疡性结肠炎基因表达调控及多聚腺苷酸化新机制

为解决溃疡性结肠炎（UC）发病机制不明的问题，中国医科大学附属盛京医院研究人员开展基于 ONT - RNA - seq 技术的研究。结果发现相关基因表达差异、APA 位点变化等。该研究为 UC 诊疗提供新视角，强烈推荐科研读者阅读。

　　

中国医科大学附属盛京医院第二消化内科的研究人员 Zhe Zhang、Dan Li、Shihang Zheng 等在《BMC Genomics》期刊上发表了题为 “Gene expression regulation and polyadenylation in ulcerative colitis via long-chain RNA sequencing” 的论文。这篇论文在溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）研究领域意义重大，为深入了解 UC 的发病机制提供了新的视角，有望为 UC 的诊断和治疗开辟新的方向。

研究背景

溃疡性结肠炎（UC）是一种主要影响结肠和直肠的慢性炎症性肠病，其特征为持续或反复的炎症，会导致肠道功能障碍。目前，UC 的确切病因尚不明确，普遍认为是遗传、环境、微生物和免疫等多种因素共同作用的结果。在诊断方面，UC 的诊断需要综合临床、实验室、影像学、内镜和组织学等多方面的标准，这使得即使是经验丰富的临床医生也可能面临诊断难题。在治疗上，虽然现有的治疗手段多样，如 5 - 氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫调节剂，以及二十一世纪以来出现的生物疗法和小分子药物，但到今年年底预计只有约 40% 的患者能实现临床缓解，20 - 30% 的患者在病程中仍需手术治疗。因此，深入探索 UC 的发病机制对于更好地控制疾病进展、优化靶向治疗和改善患者预后至关重要。

RNA 测序是一种用于研究细胞或组织中 RNA 表达的高通量测序技术，它能分析基因表达水平、剪接变异、非编码 RNA 表达等关键分子信息，在疾病研究中被广泛应用于探索发病机制、识别诊断标志物和发现治疗靶点。例如，它已被用于冠状病毒家族中 HCoV - 229E 病毒的特征分析，以及胰腺癌、肺癌、软骨肉瘤和先天性肌肉萎缩症等疾病的研究。而长链 RNA 测序（ONT - RNA - seq）技术虽然在 UC 研究中应用较少，但因其能够捕获更长的读数，直接检测 RNA 修饰和未编辑的转录本，为研究 UC 等疾病的分子机制提供了新的可能。

此外，近年来可变多聚腺苷酸化（Alternative polyadenylation，APA）作为基因表达调控的关键机制受到关注。APA 可以影响 RNA 3’端的形成，进而影响 RNA 的稳定性、核糖体加载和翻译效率，这些过程都与疾病的发展密切相关。例如，甲型流感病毒（IAV）菌株能诱导宿主细胞发生 APA，参与抗病毒反应，而 APA 的缺失会导致小鼠炎症反应增加和毒力降低，表明 APA 参与了免疫反应的调节。然而，目前关于 APA 在 UC 中的作用研究相对较少。

研究方法

1. 样本采集与处理：从 2023 年 3 月至 2023 年 5 月，研究人员收集了 7 例活动性中度溃疡性结肠炎患者（年龄在 30 - 62 岁之间，3 男 4 女，均来自中国辽宁省，病程为 2 - 5 年，经 5 - 氨基水杨酸口服治疗无效）的结肠黏膜标本，以及 7 例正常对照组（年龄在 32 - 60 岁之间，5 男 2 女，来自中国辽宁省，为非炎症、非肿瘤且带蒂结肠息肉患者，样本取自息肉切除术后邻近的正常肠黏膜组织）的标本。所有标本在结肠镜检查时获取，采集后立即在液氮罐中冷冻 30 分钟，然后储存在 - 80°C。该研究严格遵循赫尔辛基宣言的伦理原则，经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准（批准号：2023PS602K），并获得了患者的知情同意。
2. RNA 提取：使用 TRIzol 试剂（Invitrogen）按照制造商的说明从结肠组织中提取总 RNA。通过 Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific）评估 RNA 的纯度和浓度，利用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies）验证 RNA 的完整性，只有 RNA 完整性数（RIN）高于 7 的样本才用于后续的 ONT - RNA - seq 测序。
3. ONT - RNA - seq 测序：取 1 微克总 RNA，使用 cDNA - PCR 测序试剂盒（SQKPCS109；ONT）构建 cDNA 文库。产物用 T4 DNA 连接酶（NEB）与 ONT 接头连接，然后在北京 Biomarker Technology Company 的 PromethION 平台上进行测序。对原始读数进行过滤（最小读数质量得分 = 7，最小长度 = 500bp），通过 rRNA 数据库映射去除核糖体 RNA。使用 minimap2（版本 2.7 - r654）将全长非嵌合（FLNC）转录本映射到参考基因组（GRCh38_release95）。利用 cDNA - Cupcake 软件包（最小覆盖度 = 85%，最小同一性 = 90%）进一步处理映射读数，并通过多位点映射识别融合候选物。使用 Gffcompare（版本 0.1.26）将转录本与已知注释（hg38）进行比较。通过 AStalavista（版本 3.0）识别可变剪接事件，如内含子保留（IR）、外显子跳跃（ES）、可变受体（AA）和互斥外显子（MEE）。使用 MIcroSAtellite（版本 2.1）检测简单序列重复（SSR），使用 TAPIS（版本 1.2.1）进行 APA 分析。使用 DESeq2 R 包（版本 1.6.3）进行差异表达分析，将差异表达基因（Differential expression gene，DEG）定义为调整后 P < 0.01 且倍数变化（FC）≤ - 1.5 或≥1.5 的基因。
4. 功能富集分析：使用 DAVID Bioinformatics Resources（版本 6.8）工具对 DEGs 进行基因本体（Gene ontology，GO）富集分析，并使用 GO plot R 包（版本 1.0.2）可视化结果。GO 术语包括生物过程（Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）。对 P < 0.05 且 FC≤ - 1.5 或≥1.5 的前八个 BP 术语进行统计分析。
5. 靶向 miRNA 和 RBP 预测：分别使用 TargetScan 和 RBPDB 数据库预测与 APA 基因相互作用的潜在 miRNA 靶标和 RNA 结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）。
6. qRT - PCR：使用 TRIzol 方法（Invitrogen）提取总 RNA，然后使用 PrimeScrip RT 试剂试剂盒（Takara Biotechnology）将其逆转录成 cDNA。在 ABI7900 实时 PCR 系统（Applied Biosystems）上使用 Sybr Premix exTaq 试剂盒（Takara Biotechnology）进行 qRT - PCR。反应条件为：75°C 预变性 120 秒，90°C 变性 5 分钟，60°C 退火 60 秒，72°C 延伸 30 秒，共 40 个循环。使用 2 - ΔΔCT 方法计算相对表达量。
7. 统计方法：使用 SPSS v27.0 统计软件进行数据分析。正态分布的数据以均值 ± 标准差表示。对于组间比较，正态分布的数据使用单因素方差分析，非正态分布的数据使用非参数检验。P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

研究结果

1. 长读长测序揭示 UC 中的基因表达调控：利用 ONT - RNA - seq 技术分析 UC 患者和正常对照组（Normal controls，NC）之间的基因表达差异，共鉴定出 67,192 个基因（62,710 个已知基因和 252,798 个新基因）和 278,629 个转录本（10,884 个已知转录本和 25,831 个新转录本）。热图分析显示，UC 和 NC 样本之间的 Spearman 相关系数与原始基因和原始转录本呈反比。条形图展示了 DEGs 和转录本的数量。UC 和 NC 组中 DEGs 的前 10 个富集 GO 术语（生物过程）和 KEGG 通路也被展示出来。UC 组和 NC 组中关键的富集 GO 术语（生物过程）包括 “炎症反应”“免疫反应” 和 “先天免疫反应”。与 NC 组相比，UC 组中 ACSF2、NPY、SLC26A3、BRINP3 和 PKLPP2 的表达水平显著降低，而 CCL20、CCL21、CD55、IDO1、LCN2、NOS2、CCL11、OLFM4、ANXA1、REG1A、S100A9、SLPI、SPINK1 和 AGR2 的表达水平显著升高。Q - PCR 实验结果证实了这些基因在 UC 组中的表达变化。
2. 长读长测序重现 UC 中的 APA 位点选择：对 APA 选择位点的分析显示，UC 和 NC 样本之间存在显著差异。条形图表明 UC 样本中的 APA 位点数量明显多于 NC 样本，这表明 APA 位点选择发生了改变。poly (A) 位点周围 50 nt 区域的序列动力学图揭示了 APA 位点选择的潜在序列特征。散点图进一步突出了 UC 和 NC 样本之间 APA 位点的差异，表明这些变化可能有助于 UC 发病机制中基因表达的差异调节。对具有较短和较长 APA 基因的前 10 个富集 GO 术语（生物过程）进行了展示。具有较短 APA 位点的基因主要富集在 “蛋白质磷酸化”“细胞分裂”“肽基 - 丝氨酸磷酸化”“含蛋白质复合物定位”“内质网到高尔基体囊泡介导的运输” 等过程，这些过程对调节细胞周期进程、细胞凋亡和蛋白质运输至关重要。而具有较长 APA 位点的基因主要富集在 “翻译起始”“细胞迁移的正调控”“RNA 剪接”“蛋白酶体泛素依赖性蛋白质分解代谢过程的正调控” 和 “mRNA 加工” 等过程，这些过程涉及蛋白质合成、RNA 调节和蛋白质降解，可能影响基因表达动态。同时展示了较短和较长 APA 基因的前 10 个富集 KEGG 通路。这些结果表明，缩短和延长 APA 位点都参与了 UC，影响了与 UC 进展相关的各种生物过程。
3. UC 中 APA 位点选择与基因表达调控：维恩图展示了与上调 DEGs（466 个）和下调 DEGs（229 个）相对应的 APA 基因的重叠情况。对这些重叠基因的富集分析确定了前 10 个富集的 GO 术语（生物过程）和 KEGG 通路。对于上调的 DEGs，最富集的 GO 术语包括 “细胞迁移的正调控”“信号转导”“蛋白质自磷酸化”“对过氧化氢的反应”“血小板衍生生长因子受体信号通路” 和 “DNA 损伤检查点信号传导” 等，这些过程在调节细胞信号传导、迁移、氧化应激反应、DNA 修复机制和细胞凋亡中起着关键作用。对于下调的 DEGs，最富集的 GO 术语包括 “蛋白质磷酸化”“表皮生长因子受体信号通路”“细胞对 cAMP 的反应”“蛋白质定位到质膜的正调控”“细胞对胰岛素刺激的反应”“细胞内信号转导” 等，这些过程在调节细胞内信号传导、细胞骨架组织、代谢活动和运输机制中至关重要。此外，描绘 GPX7、SWAP70、CD38、NCALD 和 SMIM31 转录本的读数分布和表达模式的条形图进一步验证了 APA 位点选择可以调节 UC 中的基因表达。
4. 靶向 miRNA 的预测：为了进一步探索 APA 位点选择如何调节基因表达和影响生物过程，研究人员预测了 APA 基因的靶向 miRNA。网络图显示，miRNA - 140 - 3a 被 APA 基因 CD38 靶向，而 miR - 145 - 5p 被 APA 基因 SWAP70 靶向。这些 miRNA 可以影响许多其他基因的表达，表明 APA 基因可能通过靶向 miRNA 间接调节基因表达。维恩图显示，这些 miRNA 靶向的 35 个 mRNA 与 DE 转录本重叠。热图展示了重叠转录本的表达水平，结果显示 UC 中 SWAP70 和 CD38 的表达水平明显高于 NC 组，证实了 APA 基因可能通过 miRNA 在 UC 发病机制中调节基因表达。
5. 靶向 RBP 的预测：除了 miRNA，RBPs 在调节基因表达中也起作用。网络图显示，大量 RBPs 被多个 APA 基因（CD38、NCALD、SMIM31、GPX7 和 SWAP70）靶向，突出了 APA 基因和 RBP 之间的复杂相互作用。Upset 图展示了 DE 转录本对应的基因与 APA 基因调节的 RBP 之间的交集，显示有 24 个 DE 转录本与 APA 基因靶向的 RBPs 重叠。热图展示了这些重叠转录本的表达水平，与对照组相比，有 4 个转录本下调，20 个转录本上调。这些结果进一步证实了 APA 基因可能通过 RBPs 在 UC 中调节基因表达。

研究结论与讨论

在这项研究中，研究人员利用 ONT - RNA - seq 技术分析了 UC 患者和健康对照者之间的基因表达差异，并探讨了 APA 位点选择在 UC 发病机制中的作用。研究发现，UC 患者与 NC 患者相比，存在多个差异表达基因，这些基因主要参与炎症反应、免疫反应和信号转导等过程，这与先前的研究结果一致。例如，SLC26A3 的下调与 UC 的发病机制有关，它作为一种跨膜糖蛋白，其功能异常可能影响氯离子和碳酸氢根离子的交换，进而影响肠道微环境；CCL20 可以诱导免疫细胞释放促炎细胞因子，延长炎症反应；CD55 在 UC 患者结肠上皮细胞上的表达增强，可能与疾病活动度相关。

同时，研究观察到 UC 患者的 APA 位点选择发生了显著变化，这种变化可能通过影响 mRNA 的稳定性和翻译效率，进而影响蛋白质表达和细胞功能。研究还发现 APA 位点可以通过靶向 miRNA 或 RBP 来调节基因表达，这为理解 UC 的发病机制提供了新的视角。此外，研究确定了五个关键基因（CD38、NCALD、SMIM31、GPX7 和 SWAP70），它们可能在 UC 的发病机制中发挥重要作用。例如，NCALD 可能参与肠道平滑肌功能和肠神经系统的调节；GPX7 作为抗氧化酶，有助于保护肠道细胞免受氧化损伤；CD38 和 SWAP70 可能参与调节 UC 中的炎症反应。

然而，该研究也存在一定的局限性。由于样本量较小且可能存在选择偏倚，研究结果可能无法完全代表不同种族或地区的所有 UC 患者的情况，仅能为亚洲人群，尤其是中国人群的研究提供参考。尽管已经确定了一些关键基因和调控机制，但这些发现需要在更大的样本量和独立队列中进行验证。

总体而言，这项研究通过综合分析 DEGs、APA 位点以及预测 miRNA 和 RBP 的相互作用，构建了一个涉及多层次调控的基因表达网络。ONT - RNA - seq 技术为 UC 的分子机制研究提供了新的见解，特别是在基因表达和 APA 位点选择方面。这些发现不仅加深了我们对 UC 发病机制的理解，还可能为开发新的诊断工具和治疗策略提供潜在的分子靶点。未来的研究应进一步探索这些调控机制在 UC 和其他炎症性疾病中的具体作用，以及如何准确调节这些机制来治疗 UC，从而为 UC 患者带来更好的治疗前景。