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为解决肢体再生难题，华盛顿大学的研究人员开展 LG/J 和 SM/J 小鼠指尖再生差异研究。结果发现 LG/J 小鼠再生更优。这为探索肢体再生机制提供依据，极具科研价值，推荐科研读者阅读。
华盛顿大学（Washington University）的 Feini Qu、Kristin L. Lenz 等研究人员在《npj Regenerative Medicine》期刊上发表了题为 “Digit regeneration is expedited in LG/J healer mice compared to SM/J nonhealer mice” 的论文。这篇论文在肢体再生研究领域意义重大，为探索哺乳动物肢体再生机制提供了重要依据，有望为改善截肢患者预后带来新的思路和方法。
一、研究背景
在美国，每年约有 185,000 人因疾病或创伤失去肢体，超 200 万人长期承受着肢体缺失带来的痛苦。这不仅导致永久性身体残疾，还使患者面临社会歧视、抑郁等心理问题，下肢截肢患者一生的直接医疗费用更是高达 87 万美元。目前的假肢虽能在一定程度上改善肢体功能，但在活动范围和舒适度方面存在诸多限制，且尚无有效干预措施能恢复失去的手指和肢体。因此，实现肢体的生物再生成为医学领域亟待攻克的难题。
在脊椎动物中，组织和器官的愈合或再生能力在很大程度上取决于物种，并且通常会随着发育阶段的推进而减弱。人类的复合肌肉骨骼组织再生能力有限，但有研究表明指尖受伤后存在一定的再生现象，这暗示了人体可能具有先天的再生能力。小鼠的指尖在末端指骨（P3）远端截肢后，干细胞 / 祖细胞会形成 “芽基（blastema）”，并通过选择性增殖和分化来再生失去的组织，包括骨骼、骨髓、真皮、表皮和指甲，因此小鼠指尖成为研究哺乳动物肢体再生潜在机制的有力模型。
此外，不同近交系小鼠的再生能力存在差异。例如，MRL/MpJ “愈合者” 小鼠在 P3 截肢后的指尖再生速度比 C57BL/6 小鼠更快；LG/J（愈合者）小鼠在耳部伤口和关节软骨再生方面表现优于 SM/J（非愈合者）小鼠。已有研究对 LG/J 和 SM/J 小鼠的遗传位点进行了大量探索，发现它们与不同的愈合特性相关，但这种差异在指尖截肢后的复合组织再生中是否依然存在，尚未有明确结论。
二、研究方法
- 小鼠指尖截肢模型构建：研究人员选用 10 - 12 周龄的 LG/J 和 SM/J 小鼠，在麻醉状态下对后肢的第 2 和第 4 趾进行双侧截肢。根据截肢部位不同，分为再生（Regen，切除约 25% P3 长度）和非再生（Non-Regen，切除约 60% P3 长度）两种情况，同一肢体未受伤的第 3 趾作为对照。实验过程严格遵循相关动物实验伦理规范。
- 体内成像与分析：利用体内微型计算机断层扫描（microCT）技术，在手术前后对小鼠趾头进行成像，以量化 P3 的体积和长度。在截肢后的不同时间点（12、14、21、28、56、112 天）进行纵向扫描，记录再生过程。扫描数据经处理后，使用 Bruker CTAn 软件测量 P3 的各项参数，并计算不同再生阶段的体积和长度变化率。
- 组织学和免疫组化分析：在小鼠被安乐死后，采集趾头样本，进行固定、脱钙等处理，制作石蜡切片。通过苏木精 - 伊红（H&E）染色观察细胞和基质形态，用苦味酸天狼星红（Picrosirius Red）染色评估胶原蛋白沉积情况。免疫组化方法用于检测 Kif26b 蛋白和内皮标记物 CD31 的表达，以研究细胞增殖、血管生成和蛋白表达变化。
- 体内标记物的可视化与分析：对采集的趾头样本进行固定、蔗糖处理后，包埋在最优切割温度化合物中，制作冰冻切片。利用 Click-iT EdU 细胞增殖试剂盒标记增殖细胞，通过共聚焦显微镜观察并分析 EdU 和钙黄绿素（Calcein）标记情况，以量化不同区域（如背侧骨膜、内膜、骨髓和芽基）的细胞增殖和骨矿化情况。
- RNA 荧光原位杂交（FISH）：通过 RNA FISH 技术检测成骨转录因子 Runx2 的信使 RNA 表达，评估成骨活性相关基因的表达变化。实验过程中使用 RNAscope 多重荧光 V2 检测试剂盒，并设置阳性和阴性对照，确保实验结果的准确性。
- 统计分析：运用 GraphPad Prism 10 软件，采用双向方差分析（two-way ANOVA）或混合模型进行统计分析，通过 Tukey 事后检验比较不同基因型和截肢水平对骨骼形态、生长速率和细胞增殖的影响，以确定实验结果的显著性差异。
三、研究结果
- LG/J 小鼠的骨再生速度快于 SM/J 小鼠：通过纵向 microCT 扫描观察发现，在远端再生性截肢（Regen）后，LG/J 和 SM/J 小鼠的 P3 骨均出现初始骨降解，但 LG/J 小鼠的成骨过程启动更早。在 14 天左右，LG/J 小鼠的成骨现象已较为明显，而 SM/J 小鼠则要到一周后才出现。到 21 天时，LG/J 小鼠的骨体积和长度显著大于 SM/J 小鼠；28 天时，LG/J 小鼠的 P3 长度已超过截肢前水平，而 SM/J 小鼠直到 56 天才完全恢复 P3 长度。在近端截肢（Non-Regen）情况下，两种小鼠的指骨组织均未能完全再生，但 LG/J 小鼠的恢复程度优于 SM/J 小鼠，部分 LG/J 小鼠的 Non-Regen 趾在 56 天时达到了截肢前的长度，而 SM/J 小鼠中未出现这种情况。进一步分析不同再生阶段的骨生长速率发现，在早期生长阶段，LG/J 小鼠的骨体积和长度增长速度明显快于 SM/J 小鼠。
- LG/J 小鼠再生出高度多孔且血管化的骨：H&E 和 Picrosirius Red 染色结果显示，截肢后，LG/J 小鼠的 Regen 趾在 12 天时芽基形成更快，血管生成增强，到 21 天时胶原蛋白沉积加速，形成了高度血管化的编织小梁，与骨残端相连。相比之下，SM/J 小鼠的 Regen 趾在 12 天时炎症细胞持续存在，血管生成减少，21 天时胶原蛋白产生减少，新生血管发育较差。到 56 天时，虽然两种小鼠的远端截肢趾骨和软组织均得到恢复，但 LG/J 小鼠的再生骨孔隙更多，血管丰富。在 Non-Regen 趾方面，LG/J 小鼠在 56 天时再生骨轮廓不规则，但到 112 天时接近截肢前状态；而 SM/J 小鼠在 56 天时骨形成极少，到 112 天时软组织过度生长。此外，研究还发现，在两种基因型小鼠的 Regen 趾以及 LG/J 小鼠的 Non-Regen 趾中，21 天时芽基中的血管结构与骨生长方向一致，提示血管生成与成骨过程可能存在耦合关系。
- 增强的增殖和成骨能力促进 LG/J 小鼠的骨再生：EdU 标记结果表明，在 14 天时，LG/J 小鼠 Non-Regen 趾的芽基细胞增殖明显高于 SM/J 小鼠。进一步分析不同组织区域的细胞增殖情况发现，LG/J 小鼠在 Regen 和 Non-Regen 趾的背侧骨膜区域细胞增殖均增强。Calcein 标记显示，增殖细胞参与了新骨形成。同时，研究还检测了成骨关键转录因子 Runx2 和与异位骨化相关的蛋白 Kif26b 的表达，发现它们在两种小鼠 Regen 趾的背侧骨膜、内膜和芽基中均有丰富表达，且与早期成骨活动相关；而在 SM/J 小鼠的 Non-Regen 趾中，这两种蛋白的表达严重减弱，在未受伤的 LG/J 小鼠趾的骨膜和内膜中可检测到 Kif26b 的基础表达，但在 SM/J 小鼠中则不存在。这些结果表明，LG/J 小鼠截肢后再生反应增强，部分原因是骨膜来源的骨祖细胞具有强大的增殖和成骨能力。
四、研究结论与讨论
本研究表明，与 SM/J 非愈合小鼠相比，LG/J 愈合小鼠在末端指骨（P3）不同水平截肢后，表现出更优越的再生能力。这种再生优势体现在骨再生速度加快、再生骨质量更好（高度多孔且血管化）以及相关细胞增殖和成骨能力增强等方面。研究结果支持了 LG/J 小鼠的遗传可继承再生表型适用于多种肌肉骨骼损伤的假设，包括指尖截肢。
从分子机制角度来看，LG/J 小鼠中 Runx2 和 Kif26b 等基因的高表达，可能使其骨祖细胞比 SM/J 小鼠的细胞更具成骨活性。Kif26b 不仅能刺激细胞增殖和成骨基因表达，还在血管生成中发挥作用，这进一步解释了 LG/J 小鼠再生过程中血管生成与成骨的协同优势。此外，遗传变异可能通过影响全身生理状态间接影响再生，例如 SM/J 小鼠较高的免疫反应、葡萄糖不耐受和糖尿病倾向，可能对伤口愈合产生负面影响。
然而，研究也存在一些局限性。虽然观察到 LG/J 小鼠的再生优势，但具体机制尚未完全明确，不清楚加速的骨再生是与特定成骨基因的遗传变异有关，还是与更广泛的系统差异（如免疫反应）相关。研究仅关注了 LG/J 和 SM/J 亲本菌株，未对杂交小鼠进行研究，且不确定 LG/J 小鼠再生潜能增强是源于细胞特性、细胞外基质特征还是两者共同作用。未来研究可通过评估 LG/J 和 SM/J 小鼠骨膜来源的骨祖细胞的增殖和成骨能力，以及进行不同截肢水平的细胞移植实验来深入探究这些问题。此外，研究中 112 天时间点的样本量较少，后续应增加样本量以更全面地捕捉稳态下的生物学变异。
尽管如此，这项研究为深入理解哺乳动物肢体再生机制提供了重要线索。对干细胞 / 祖细胞来源以及促进或抑制其活性的信号的进一步研究，将有助于开发出刺激截肢部位复合肌肉骨骼再生的方法。从长远来看，将研究成果应用于更接近临床的手指或肢体截肢模型，有望延长截肢残端骨长度，使假肢适配性更好，从而显著提高肢体损伤患者的生活质量，为再生医学领域带来新的希望和突破。
