前沿探索：多模型蛋白质组学剖析胰腺导管腺癌研究模型，开启胰腺癌精准诊疗新征程

为解决 PDAC 治疗难题及研究模型与患者差异问题，挪威科技大学研究人员开展胰腺导管腺癌研究模型的蛋白质组学分析。研究生成多模态数据集，对胰腺癌研究意义重大，推荐科研读者阅读，助您了解前沿成果。

　　

挪威科技大学（Norwegian University of Science and Technology）临床与分子医学系的 Mathilde Resell 等人在《Scientific Data》期刊上发表了题为 “Proteomics profiling of research models for studying pancreatic ductal adenocarcinoma” 的论文。该研究成果在胰腺癌研究领域意义重大，为深入了解胰腺癌的发病机制、开发更有效的治疗手段提供了关键的数据支持，有助于推动从实验室研究到临床试验的转化医学进程。

研究背景

胰腺癌是一种极其致命的恶性肿瘤，其中胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）占所有胰腺癌病例的 90% 以上。其五年生存率仅为 10 - 15%，中位生存期只有 4.6 个月。PDAC 在临床检测时往往已处于晚期，并且对化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗等多种针对其他癌症有效的治疗手段具有抗性。目前，PDAC 治疗困难的分子机制尚不清楚，因此迫切需要加速 PDAC 的转化研究或转化医学（即 “从实验室到临床” ，旨在识别生物标志物以开发有效治疗方法）的进展。

转录组学在多种癌症研究中应用广泛，但由于胰腺腺泡细胞中核糖核酸酶和蛋白酶消化酶水平较高，难以制备高质量的 RNA，使得转录组学在胰腺癌研究中面临挑战，尤其是在以正常胰腺组织为对照研究 PDAC 时。在本研究中，研究人员采用 “定性蛋白质组学” 方法，对从多种研究模型收集的生物样本中的蛋白质（及其相对强度）进行了鉴定。不同研究模型之间存在异同，选择不同的研究模型通常取决于研究目的。而 PDAC 转化医学面临的一个重大障碍是研究模型与患者之间存在差异。为了理解和解决这一挑战，研究人员展示了不同研究模型和患者的蛋白质组学数据集。

研究方法

1. 伦理考量：所有涉及人类参与者和动物的实验程序均严格遵循机构和国家研究委员会的伦理标准，以及《赫尔辛基宣言》及其后续修正案或类似伦理标准。人类肿瘤组织样本来自奥斯陆大学医院（OUH）的胰腺生物样本库。
2. 样本采集：从 8 种研究模型中收集了 30 个生物样本。细胞、小鼠 PDAC 肿瘤组织和小鼠正常胰腺组织各收集 6 个样本；小鼠 PDAC 球体、人类 PDAC 类器官和人类 PDAC 组织各收集 3 个样本；小鼠胰腺外分泌类器官收集 2 个样本；小鼠 PDAC 类器官收集 1 个样本。每个模型中类器官的数量估计为 2000 - 6000 个。样本量的选择基于研究期间的资源情况，使用 6 只 PDAC 小鼠和 6 只正常小鼠，以满足 “定量蛋白质组学” 所需的 95% 置信区间要求。
3. 研究模型制备
   • 小鼠 PDAC 细胞系：UN - KC - 6141 细胞系源自一只模拟人类 PDAC 的基因工程小鼠的胰腺肿瘤，该小鼠携带 KrasG12D;Pdx1 - Cre 突变，在 50 周龄时采集肿瘤。细胞培养过程包括传代培养，使用特定的试剂、材料和设备，以确保细胞系保留关键的遗传特征。
   • 小鼠 PDAC 球体：利用上述细胞，采用悬滴法生成 PDAC 球体，使用第 39 代细胞。将含有 60000 个细胞 / 27μl 的液滴置于培养皿盖底面，倒置后依靠表面张力和重力固定，培养皿中加入 1ml 培养基，在 37°C、5% CO?的湿润培养箱中培养 7 天后收集用于蛋白质组分析。
   • 小鼠 PDAC 类器官和正常小鼠胰腺外分泌类器官：PDAC 类器官最初由冷泉港实验室从 C57BL/6 小鼠的 PDAC 组织中分离获得，正常胰腺外分泌类器官购自 Stem Cell Technologies。小鼠类器官生长速度快于人类类器官，传代时分裂比例为 1:4 - 1:8。
   • 人类 PDAC 类器官：类器官购自 ATCC，源自一位 61 岁女性胰腺头部的原发性胰腺组织，该患者被诊断为 III 期 PDAC 且未接受过新辅助治疗。由于人类类器官增殖较慢且在较高密度下生长更好，分裂比例为 1:1 - 1:3，解冻和易受压力阶段添加 Rho 激酶抑制剂以提高类器官活力。
   • 小鼠 PDAC 肿瘤组织和小鼠正常胰腺组织：将小鼠 PDAC 细胞（2.5×10?个，第 32 代）注射到 5 - 8 周龄的 C57/BL6 小鼠胰腺中，同时纳入年龄、性别和基因匹配的正常小鼠。收集 PDAC 肿瘤组织和正常胰腺组织。
   • PDAC 患者的肿瘤组织：对三名患者进行手术活检，获取直径 2mm、长度最长 10mm 的组织圆柱体，切成至少 5 块用于电子显微镜检查；同时获取直径 3mm、长度最长 10mm 的组织圆柱体，保存在液氮罐中用于蛋白质组学研究。
   
   
4. 形态学评估：通过苏木精 - 伊红（H&E）染色、甲苯胺蓝（TBO）染色和免疫组织化学（IHC）在光学显微镜水平进行评估；通过酒精醋酸铀和柠檬酸铅（UA - LC）染色用于透射电子显微镜（TEM），或溅射镀金 / 钯用于扫描电子显微镜（SEM）在超微结构水平进行评估。
5. 蛋白质组学分析：样本添加 450μl 100mM Tris - HCl pH - 8.5（细胞实验省略此步），调整缓冲液成分后超声处理，加热，离心去除杂质。取 50μg 可溶性蛋白质，加入胰蛋白酶消化过夜。肽段经 C18 自旋柱脱盐、干燥后重悬于 0.1% 甲酸，进行 LC - MS/MS 分析。使用 timsTOF Pro（Bruker Daltonics）连接 nanoElute（Bruker Daltonics）HPLC 进行分离检测，仪器在 DDA PASEF 模式下运行，设置相关参数。
6. 数据分析：使用 MaxQuant 软件通过 Andromeda 搜索引擎识别肽段，并使用无标记定量（LFQ）对蛋白质进行定量。MaxLFQ 利用先进算法跨多个样本提取和归一化肽段信号以确定蛋白质丰度，软件还能对齐保留时间和匹配特征，确保蛋白质定量准确可靠。设置错误发现率为 1%，仅使用高置信度的独特肽段进行最终蛋白质组鉴定。

研究结果

1. 蛋白质鉴定：在研究模型和患者中检测到的蛋白质总数，以 uniport ID 计在 2723 - 5800 之间，以基因名计在 2698 - 5726 之间。
2. 测量质量评估
   • 小鼠 PDAC 细胞：细胞在培养过程中保持上皮特征，形态学观察显示细胞呈多边形、单层生长。功能上，细胞对化疗药物产生耐药性，从第 27 代到第 38 代，IC??从 50.0nM 升高到 191.0nM。MS 数据分析显示，肽离子的 dmass 分布峰值接近零（0.002），质量误差 ppm 分布在 1 - 8 之间，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，大部分肽段未发生错切，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（46.58%）和 10 - 20（18.19%），六个样本间 log?转换强度值呈正相关，蛋白质组强度变异系数（CV）峰值小于 25%。
   • 小鼠 PDAC 肿瘤组织：细胞注射到胰腺后形成肿瘤，胰腺重量增加。形态学显示肿瘤细胞密度高、核结构异常。MS 数据分析与小鼠 PDAC 细胞类似，dmass 分布峰值接近零（0.002），质量误差 ppm 分布在 1 - 8 之间，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（39.57%）和 10 - 20（19.92%），样本间 log?转换强度值呈正相关，蛋白质组强度 CV 峰值小于 50%。
   • 小鼠正常胰腺组织：光镜和 TEM 下显示胰腺外观正常，尤其是外分泌部分。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零（0.002），质量误差 ppm 分布在 1 - 6 之间，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（43%），样本间 log?转换强度值呈正相关，蛋白质组强度 CV 峰值约为 25%。
   • 小鼠 PDAC 球体：光镜和 SEM/TEM 下显示球体组织结构紧密。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零（0.002），质量误差 ppm 接近零，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（31.69%），三个样本间 log?转换强度值可能呈正相关，蛋白质组强度 CV 峰值约为 60%。
   • 小鼠 PDAC 类器官：光镜和 SEM/TEM 下显示类器官特征。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零（≈ - 0.003），质量误差 ppm 接近 - 5，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（32.08%）。
   • 小鼠胰腺外分泌类器官：光镜和 SEM/TEM 下显示正常胰腺外分泌类器官特征。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零（≈ - 0.002），质量误差 ppm 接近 - 4，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（27.94%），两个样本间 log?转换强度值存在相关性，蛋白质组强度无明显 CV 峰值。
   • 人类 PDAC 类器官：光镜和 SEM/TEM 下显示类器官特征，细胞图像分析显示类器官大小不一，增殖活性高，凋亡活性低。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零（≈0.001），质量误差 ppm 接近 1，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（20.98%），三个样本间 log?转换强度值可能呈正相关，蛋白质组强度 CV 峰值约为 25%。
   • 人类 PDAC 肿瘤组织：选择的三名患者具有典型的 PDAC 组织学、细胞学和超微结构特征。MS 数据分析显示 dmass 分布峰值接近零，质量误差 ppm 接近 - 3，肽长度与 m/z 呈正相关，酶切效率高，蛋白质序列覆盖率主要集中在 0 - 10（33.37%），样本间 log?转换强度值呈正相关，蛋白质组强度 CV 在 25% - 100% 之间。
   
   

研究结论与讨论

本研究通过蛋白质组学系统建模，从多种研究模型（包括小鼠和人类来源的细胞、球体、类器官和组织）生成多模态数据集。这些数据集有助于比较研究模型与人类 PDAC 组织之间的异同，识别潜在的匹配和不匹配之处。例如，通过系统建模比较，能够帮助选择与人类 PDAC 组织最相似的研究方法，为未来研究提供指导，促进更有效 PDAC 治疗方法的开发。

数据集还可用于多种研究，如通过分析关键蛋白质和信号通路识别新的药物靶点，深入了解疾病机制，发现用于治疗监测的生物标志物，开发针对 PDAC 多个方面的治疗策略，以及验证各种研究模型的代表性。数据收集（尤其是进一步丰富后）对于数据挖掘（如聚类或分割）和知识发现也具有重要价值，还可能对单个模型的生物信息学研究有用。

研究人员公开这些数据集，有助于研究社区共同增进对 PDAC 的理解，加速实验室研究与临床试验之间的转化研究，符合欧洲健康数据空间（EHDS）的要求，为研究、创新、政策制定和监管活动提供了一致、可信和高效的健康数据重用系统。总之，该研究为 PDAC 的研究提供了丰富的数据资源和新的研究思路，对推动胰腺癌领域的发展具有重要意义。