新型紧凑 CRISPR-Cas 效应物 Cas12h1 的前沿分子解析与理性工程构建 —— 开拓基因组编辑与分子诊断新视野

为解决 CRISPR-Cas 系统应用局限问题，福建师范大学研究人员开展 Cas12h1 相关研究。他们揭示其特性及机制，开发出 Cas12h1hf。该研究拓展了 CRISPR 工具库，对基因组编辑和分子诊断意义重大，值得科研人员一读。

　　

福建师范大学生命科学学院（Key Laboratory of Microbial Pathogenesis and Interventions of Fujian Province University, the Key Laboratory of Innate Immune Biology of Fujian Province, Biomedical Research Center of South China, Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of the Ministry of Education, College of Life Sciences, Fujian Normal University）的 Weiwei Zheng、Hongyu Li 等研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了题为 “Molecular insights and rational engineering of a compact CRISPR-Cas effector Cas12h1 with a broad-spectrum PAM” 的论文。这篇论文在基因编辑和分子诊断领域意义重大，为相关研究开辟了新方向，有望推动这些领域取得新的突破 。

研究亮点

该研究揭示了 Cas12h1 作为核酸内切酶的诸多特性，包括其切口酶偏好性、独特的 PAM（原间隔序列邻近基序^[1]）识别序列、作用机制等。研究人员还通过理性设计开发出高保真核酸检测器 Cas12h1hf，这一系列成果极大地拓展了 CRISPR（规律成簇间隔短回文重复^[2]）工具在基因组编辑和分子诊断方面的应用。

研究背景

CRISPR-Cas 系统作为原核生物的适应性免疫系统，能够抵御噬菌体和其他移动遗传元件的入侵。凭借其强大的功能，该系统已发展成为具有开创性的基因组编辑技术。根据效应分子数量，CRISPR-Cas 系统可分为 1 类和 2 类，其中 2 类系统因由单个多功能结构域蛋白构成，在基因组编辑应用中备受关注。2 类系统又进一步分为 6 种类型，II 型的 Cas9、V 型的 Cas12 和 VI 型的 Cas13 都属于这一类别。Cas9 因精准度高、效率高和适应性强而被广泛应用，但它也存在一些局限性，比如分子量大，给细胞递送带来困难；对 PAM 序列要求特定，限制了靶基因的选择范围；保真度有限，对与 gRNA（向导 RNA^[3]）不完全互补的序列容忍度较高。

V 型 CRISPR-Cas 系统，也就是 Cas12 家族，包含从 V-A 到 V-O 等多种亚型，是 CRISPR-Cas 系统中最多样化的家族。V 型 Cas 效应蛋白大小不一，能在单 RNA 或双 RNA 的引导下识别双链 DNA（dsDNA）、单链 DNA（ssDNA）或单链 RNA（ssRNA） 。激活后，多数 V 型 Cas 效应蛋白可降解靶标 dsDNA（顺式切割），产生交错末端，在精确整合 DNA 序列等应用中具有优势。此外，它们还能非特异性地切割环境中的 ssDNA 或 ssRNA（反式切割或旁系切割），基于这一特性，已被开发为核酸检测器。

在 V 型 CRISPR 系统众多成员中，Cas12h1 独具特色。它的 PAM 序列要求与大多数 Cas12 亚型不同，偏好富含嘌呤的序列（5’-RTR-3’），这扩大了可编辑基因组位点的范围。同时，作为 V-H 亚型成员，Cas12h1 相对较小（仅含 870 个氨基酸），是一种由单一 crRNA（CRISPR RNA^[4]）引导、具备高效 DNA 切割能力的紧凑型 DNA 内切酶，在基因组编辑方面潜力巨大。而且，它与其他 Cas12 效应蛋白序列相似度低，暗示其可能蕴含尚未被探索的丰富功能多样性。不过，目前对 Cas12h1 核酸酶活性的特征了解还不够清晰，其潜在分子机制也有待进一步阐明。

研究方法

1. 蛋白质表达和纯化：将编码 Cas12h1 或其变体的 pET30b 载体与编码 CRIPSR 阵列的 pCDFDuet-1 载体共转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3) 细胞中，经 IPTG 诱导表达，再通过镍柱、肝素柱和分子筛等多步纯化获得目的蛋白。

2. 冷冻电镜（Cryo-EM）数据收集和处理：把制备好的蛋白复合物滴加到 Au 300 目 R1.2/1.3 网格上，用 Vitrobot Mark IV plunger 进行处理后，在液氮冷却的乙烷中快速冷冻。随后，在 300 kV 的 Titan Krios 显微镜上收集冷冻电镜数据，并利用 MotionCor2、CTFFIND-4.1、cryoSPARC 和 RELION-3.1 等软件进行处理分析。

3. 模型构建和优化：运用 Coot 软件构建 Cas12h1 复合物模型，再使用 Phenix.real_space_refine 进行优化，最后借助 PyMol 和 ChimeraX 软件进行分子可视化处理。

4. 体外切割实验：进行超螺旋质粒切割实验和寡核苷酸切割实验，以检测 Cas12h1 的切割活性。

5. 荧光基团 - 猝灭剂（F-Q）实验：用于检测 Cas12h1 的反式切割活性，评估不同激活剂对其激活效率的影响 。

研究结果

1. Cas12h1 在体内展现出强大的编辑效能和不对称切割特性：研究人员通过将含有失活 GFP（绿色荧光蛋白^[5]）盒的质粒与编码 Cas12h1 及靶向不同 DNA 链的 RNA 向导共转染到 HEK293T 细胞中，开展 GFP 激活实验。结果发现，当仅转染靶向一条链的向导时，几乎观察不到荧光；而同时转染靶向正义链和反义链的向导时，高达 62% 的细胞出现编辑，GFP 信号得以恢复，且其编辑效率高于类似大小的 Cas12j2。这表明 Cas12h1 有望成为一种高效的基因编辑切口酶。

2. Cas12h1 在体外呈现不对称 dsDNA 切割特性：重构野生型 Cas12h1-crRNA 二元复合物（监测复合物）后进行体外切割实验。结果显示，该复合物能在最低 50 nM 浓度下切割带有互补序列和 5’-ATG-3’ PAM 的超螺旋质粒 DNA，且在较宽温度范围内都具有活性。通过 S1 核酸酶处理和 Sanger 测序等方法进一步研究发现，Cas12h1 倾向于在非靶标链（NTS）DNA 上切割，切割位点位于 PAM 序列下游 13 nt 处，而在靶标链（TS）DNA 上几乎没有切割位点。在高浓度（4 μM）下，Cas12h1 能在 30 秒内切割 NTS DNA，而对 TS DNA 的切割则需要 2 分钟，进一步证实其优先切割 NTS DNA 的特性。此外，研究还发现 dsDNA 或 ssDNA 激活剂的长度会影响 Cas12h1 的反式切割活性，dsDNA 激活剂的激活效率更高 。

3. Cas12h1WT-crRNA 监测复合物的整体特征：利用冷冻电镜解析监测复合物结构，分辨率达到 3.0 ?。Cas12h1 呈双叶结构，类似 “蟹爪” 形状，由识别（REC）叶和核酸酶（NUC）叶组成，中间通过 WED 结构域相连。成熟的 crRNA 形成独特的茎环结构，其重复序列衍生部分比其他 V 型 crRNA 大，且 5’端插入 WED 结构域形成的正电荷凹槽中。crRNA 的前 5 个核苷酸为预有序种子序列，对靶标识别至关重要，单核苷酸错配实验表明，种子序列中不同位置的错配对顺式和反式切割活性影响不同 。

4. Cas12h1WT-crRNA-dsDNA 干扰复合物的结构揭示了 V 型 Cas 效应蛋白的结构相似性：组装 Cas12h1WT-crRNA-dsDNA 三元复合物（干扰复合物）并解析其结构，分辨率为 3.0 ?。在干扰状态下，之前在监测复合物中不可见的 PI 结构域变得稳定，crRNA 的间隔区与互补的 TS DNA 形成 17 bp 的 A - 型异源双链。进化分析显示，Cas12h1 与 Cas12b 结构最为相似，且处于较早的进化阶段。通过比较不同 Cas 效应蛋白的结构，发现它们在结构和功能上存在一定的相似性和差异性 。

5. Cas12h1 识别广谱 PAM 的机制：通过对 PAM 序列进行突变并检测切割活性，发现 Cas12h1 识别的 PAM 序列比之前报道的更广泛，为 5’-DHR-3’（D 代表 A、T 或 G，H 代表 A、T 或 C，R 代表 A 或 G）。从结构上看，PAM 双链位于由 PI、WED 和 Helical I 结构域形成的正电荷裂隙中，Cas12h1 通过与 PAM 双链的磷酸骨架和碱基形成氢键来实现识别，多个关键氨基酸残基的突变会显著影响其切割能力 。

6. R 环形成机制：在 Cas12h1 -crRNA-DNA 干扰复合物中，DNA 双链在 PAM 双链之外解开。研究发现，多个基序和残基参与了靶标解旋和异源双链形成过程。例如，连接螺旋 α3 和 α4 的环起到促进 DNA 解旋的作用，R408 通过与 dC (0) 的磷酸骨架形成氢键来稳定异源双链，成熟的 crRNA 在 A (1) 位置发生约 180° 的转向，这些都对 R 环形成至关重要 。

7. Cas12h1 的催化位点：RuvC 和 Nuc 结构域形成口袋容纳 NTS，RuvC 结构域中的三个酸性残基（D465、E658 和 D740）构成催化中心。Mg2?对 Cas12h1 的靶标降解至关重要，Mn2?或 Co2?可增强其对 TS 的切割作用。对催化位点关键残基进行丙氨酸替代突变实验表明，不同残基对顺式和反式切割活性的影响存在差异 。

8. Cas12h1 的激活过程：重构 Cas12h1 D465A 突变体、crRNA 和靶标 DNA 组成的 R 环形成复合物并解析其结构，分辨率为 2.76 ?。结构比较发现，Cas12h1 从监测状态到 R 环形成状态发生了显著的构象重排。在监测状态下，一个柔性的盖子基序（lid motif）阻挡了催化位点；靶标识别后，盖子基序发生 “从柔性到稳定” 的转变并向上旋转，暴露催化位点，使 NTS 进入催化口袋进行切割 。

9. Cas12h1 作为核酸检测器的开发：比较 Cas12h1 与常用的 LbCas12a 的反式切割效率，发现 Cas12h1 在更短时间内产生更显著的荧光，且在室温下 10 分钟就能产生可见荧光，温度升高荧光更明显，表明它有望成为无需设备、省时的核酸检测器。通过对 Cas12h1 进行蛋白质工程改造，将与核酸相互作用的负电荷残基替换为中性残基，得到了对单碱基错配更敏感的 Cas12h1hf。实验显示，Cas12h1hf 能够区分猴痘病毒（MPXV）与其他正痘病毒，是一种具有单碱基分辨率的高特异性核酸检测器 。

研究结论与讨论

该研究系统地探究了 Cas12h1 的生化特性，阐明了其作用的分子机制，并将其理性设计成高特异性核酸检测器 Cas12h1hf，为基因组编辑和分子诊断提供了新工具。

与大多数产生 dsDNA 断裂的 Cas12 效应蛋白不同，Cas12h1 优先作为切口酶发挥作用，在人类细胞中也呈现出相同特性，这为基因组编辑提供了一种新的小型化、PAM 识别范围广的切口酶工具。结构和系统发育分析表明，噬菌体可能是 Cas12h1 的生物学起源，Cas12h1 和 Cas12b 可能存在共同的进化机制 。

Cas12h1 识别的广谱 PAM 序列 5’-DHR-3’，为开发新的 “无 PAM” Cas 变体提供了结构基础，有望突破 PAM 序列对靶标选择的限制，推动精准基因组编辑的发展。其独特的激活方式，即盖子基序 “从柔性到稳定” 的转变，揭示了 V 型 Cas 效应蛋白激活机制的多样性 。

通过蛋白质工程改造获得的 Cas12h1hf 对单碱基错配更加敏感，结合其宽温度适应性和快速切割动力学的特点，使其成为一种极具前景的即时检测病原体和其他核酸的诊断工具。这项研究加深了人们对 Cas12 效应蛋白的理解，拓展了 CRISPR 工具库，为开发更可靠的基因组编辑和核酸诊断工具提供了重要参考 。

总的来说，该研究成果在基因编辑和分子诊断领域具有重要的理论和实践意义，为相关领域的进一步发展奠定了坚实基础，有望在未来带来更多创新性的应用和突破。

注释：
[1] 原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）：是一段位于靶 DNA 序列附近的短核苷酸序列，Cas 蛋白需要识别 PAM 序列才能结合并切割靶 DNA，不同的 Cas 蛋白识别的 PAM 序列不同。
[2] 规律成簇间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）：是一种广泛存在于细菌和古菌基因组中的特殊 DNA 序列，与 CRISPR 相关蛋白（Cas）共同构成 CRISPR-Cas 系统，用于抵御外来核酸的入侵。
[3] 向导 RNA（guide RNA，gRNA）：在 CRISPR-Cas 系统中，gRNA 能够引导 Cas 蛋白识别并结合特定的靶 DNA 序列，决定了 Cas 蛋白的切割位点。
[4] CRISPR RNA（crRNA）：是 CRISPR-Cas 系统中的一种 RNA 分子，由 CRISPR 阵列转录加工而成，包含与靶 DNA 互补的间隔序列和重复序列，在 Cas 蛋白识别和切割靶 DNA 过程中发挥重要作用。
[5] 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）：是一种能够发出绿色荧光的蛋白质，常被用作报告基因，用于检测基因表达、细胞定位等生物学过程。