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为解决 NACT 对乳腺癌患者外周单核细胞影响及预后贡献不明的问题，亚历山大大学研究人员开展相关研究。结果发现 NACT 影响 CD14+CD16 + 单核细胞和 sCD163 水平，且二者与临床反应有关。该研究为乳腺癌治疗提供新思路，值得一读。
埃及亚历山大大学医学研究所免疫学与过敏学系（Department of Immunology and Allergy, Medical Research Institute, Alexandria University）的研究人员 Sara Youssry、Hossam Ghoneim、Riham Barakat 以及癌症管理与研究系（Cancer Management and Research Department）的 Eman ElAlfy，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Effect of neoadjuvant chemotherapy on CD14 + CD16 + monocytes and soluble CD163 in Egyptian breast cancer patients” 的论文。这篇论文在乳腺癌治疗研究领域意义重大，它聚焦于新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy，NACT）对埃及乳腺癌患者体内特定免疫细胞及相关分子的影响，为进一步了解乳腺癌的治疗机制、优化治疗方案提供了重要依据 。
研究背景
乳腺癌是全球女性中最常见的癌症之一。2020 年，全球乳腺癌预估发病 230 万例，预计到 2070 年这一数字将攀升至 440 万 。在埃及，乳腺癌同样是女性中最为普遍的恶性肿瘤，约占新增癌症病例的 32.4%。
乳腺癌细胞会与多种先天免疫细胞相互作用，像自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞以及单核细胞 / 巨噬细胞等，这些免疫细胞能调控肿瘤细胞的增殖、发展和转移进程。其中，单核细胞亚群会对肿瘤的存在产生反应，并且与肿瘤特征以及治疗效果都有关系。
新辅助化疗（NACT）在乳腺癌治疗中被广泛应用，它能通过改变免疫微环境来影响抗癌反应，不过，NACT 对不同单核细胞亚群的作用以及它们在化疗中的预后贡献还尚不明确。另外，循环单核细胞是一群异质性细胞，可分为 CD14+CD16 - 细胞和 CD14+CD16 + 细胞。CD14+CD16 + 单核细胞能产生促炎细胞因子，在炎症状态下其数量会显著增加，而且可能是乳腺癌早期诊断的有用指标 。
CD163 是单核细胞 / 巨噬细胞的清道夫受体，在肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）上高表达，被视为巨噬细胞活化的标志物。可溶性 CD163（sCD163）是膜蛋白经蛋白水解后释放到血清或其他体液中的物质。有研究报道，肿瘤患者血清中 sCD163 水平升高，可用于估算体内抗炎性 2 型巨噬细胞（M2）的总量，在部分癌症中，血清 sCD163 可能还是一种新的预后标志物。但在乳腺癌中，sCD163 的临床意义和预后价值却鲜为人知。因此，开展此项研究，对于揭示乳腺癌治疗过程中免疫细胞和相关分子的变化规律，进而提升治疗效果十分必要。
研究方法
- 研究对象：该研究选取了 30 例接受 NACT 的侵袭性乳腺癌患者，同时挑选了 15 名年龄匹配的健康女性作为对照组。患者均来自亚历山大大学医学研究所癌症管理与研究系。研究人员详细记录了患者的年龄、肿瘤类型、分期、分级、淋巴结受累情况、血管侵犯、肿瘤转移，以及雌激素受体 / 孕激素受体和人表皮生长因子受体 2（HER2）状态等临床病理参数。排除标准包括有其他癌症病史、免疫介导疾病史以及组织学结果不明确的患者。在获取所有受试者的书面知情同意后，采集静脉血样本，且研究遵循《赫尔辛基宣言》中关于人体受试者使用的原则。
- 化疗方案与研究设计：标准的新辅助治疗方案为每 21 天进行 4 个周期的阿霉素和环磷酰胺（AC）治疗（阿霉素 60mg/m2，环磷酰胺 600mg/m2），随后每周使用紫杉醇（Taxol）（80mg/m2），共 12 剂 。在 NACT 第 1 周期前（第 1 组；NACT 前）、接受 4 个周期 AC 后（第 2A 组；4AC）以及完成 NACT 方案最后 1 周期后（第 2B 组；4AC + Taxol）分别采集患者血样。
- 肿瘤对 NACT 的临床反应评估：由两名独立且经验丰富的医生，通过体格检查和超声测量，直接测量肿瘤的两个轴（最长轴和与其垂直的最长轴），依据国际抗癌联盟标准评估肿瘤对 NACT 的临床反应。原发部位无任何可触及肿块的临床证据视为完全临床缓解（cCR），二维肿瘤体积测量值减少 50% 或更多则定义为部分临床缓解（cPR） 。分别在接受 4 个周期 AC 后（第 2A 组；4AC）和完成 NACT 方案最后 1 周期后（第 2B 组；4AC + Taxol）进行反应评估。
- 外周血单个核细胞（PBMCs）分离：将肝素化的静脉血样本稀释后，轻轻铺在 Ficoll-Hypaque（1077）上，1800rpm 离心 30 分钟，小心吸取含有 PBMCs 的界面细胞，离心沉淀后重悬于 1ml RPMI（1640）中，用血细胞计数板和台盼蓝（0.2%）测定细胞数量和活力。
- PBMCs 的短期培养：将 PBMCs（2×10?细胞 /ml）接种于 24 孔组织培养板中，加入多克隆单核细胞激活剂脂多糖（LPS）（100ng/ml），在 37°C、5% 湿度的 CO?培养箱中孵育 24 小时，收集上清液并储存于 -80°C，用于评估 sCD163 浓度。
- CD14 和 CD16 表面表达分析：用抗人白细胞抗原（HLA）-DR 藻红蛋白（PE）、抗人 CD14 异硫氰酸荧光素（FITC）和抗人 CD16 藻红蛋白（PE）对新鲜分离的 PBMCs 进行染色。基于细胞大小和复杂性对单核细胞进行设门，在 HLA-DR/CD14 图中排除 HLA-DR 阴性的 NK 细胞，然后分析细胞的 CD14 和 CD16 表达，以确定双阳性单核细胞亚群。通过双色流式细胞术测定 CD14 和 CD16 的表达，使用 BD FACS Calibur 流式细胞仪和 Cell Quest 软件进行检测。
- sCD163 水平检测：根据商用夹心 ELISA 试剂盒（Bioassay Technology Laboratory）的说明书，测定 NACT 干预前后培养上清液（诱导 sCD163）和血清中 sCD163 的浓度。
- 统计分析：研究数据以均值 ± 标准差表示，使用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。通过 Shapiro-Wilk 检验评估数据的正态性，采用 Mann-Whitney 检验比较两组非正态分布的定量变量，使用单因素方差分析进行多重比较，并进行事后检验。以 5% 为显著性水平判断结果的显著性。
研究结果
- 乳腺癌患者的人口统计学和病理数据：30 例侵袭性乳腺癌患者入组，其人口统计学和病理特征总结如下：年龄≤45 岁的患者占 40%，＞45 岁的占 60%；无家族病史的患者占 86.7%；绝经状态方面，未绝经的占 46.7%，已绝经的占 53.3%；肿瘤分期为 II 期的占 33.3%，III 期的占 66.7%；淋巴结分期 cNO 占 13.3%，cN1 占 33.3%，cN2 占 40%，cN3 占 13.3% ；组织学类型中，浸润性导管癌（IDC）占 86.7% ；肿瘤分级 GII 占 93.3%；雌激素受体（ER）阳性占 76.7%；孕激素受体（PR）阳性占 66.7%；HER2 阴性占 76.7% 。
- NACT 对乳腺癌患者外周血生物标志物的影响：NACT 显著改变了患者的绝对中性粒细胞计数（ANC）、绝对淋巴细胞计数（ALC）和绝对单核细胞计数（AMC）。NACT 期间，ANC 和 ALC 显著下降，与 NACT 前（第 1 组）相比，NACT 后（第 2A 组和第 2B 组）的 ANC 和 ALC 均值明显降低。而 AMC 水平在 4 个周期 AC 治疗后（第 2A 组；4AC）升高，在紫杉醇治疗后（第 2B 组；4AC + Taxol）下降至对照组水平。
- NACT 对乳腺癌患者双阳性 CD14+CD16 + 单核细胞亚群的影响：NACT 使 CD14+CD16 + 单核细胞亚群比例显著下降，与第 1 组（NACT 前）相比有明显减少。在紫杉醇治疗组（第 2B 组；4AC + Taxol）中，该亚群比例相较于第 2A 组（4AC）下降更为显著。不过，即便经过 NACT 治疗，患者体内该亚群比例仍显著高于对照组（p<0.001）。
- NACT 对乳腺癌患者 sCD163 水平的影响：所有患者组血清和诱导 sCD163 水平均显著高于对照组（p<0.001）。NACT 后，血清和诱导 sCD163 水平均显著低于 NACT 前。在第 2B 组（4AC + Taxol）中，血清 sCD163 水平与 CD14+CD16 + 亚群比例呈正相关（rs =0.374，p=0.042）。
- 双阳性单核细胞和 sCD163 水平与 NACT 临床反应的关联：血清 sCD163 水平和双阳性单核细胞百分比均与 NACT 的部分反应显著相关（p=0.005 和 < 0.001） 。
研究结论与讨论
临床完全缓解（cCR）是接受 NACT 的乳腺癌患者良好生存的替代终点，免疫浸润情况能预测乳腺癌患者的预后和对化疗的敏感性，但 NACT 下患者免疫细胞的动态变化尚不明确。先天免疫系统在肿瘤免疫监视中作用重大，不过目前乳腺癌治疗中预测化疗反应的生物标志物较少，急需开发可靠且成本低廉的生物标志物。
该研究发现，与 4 个周期 AC 的 NACT 相比，基于紫杉醇的 NACT 会使 AMC 显著下降，这与之前报道中实体癌患者 AMC 升高预后较差相契合，反映出紫杉醇完整治疗方案对 AMC 的降低作用。而环磷酰胺治疗时 AMC 升高，可能是因为环磷酰胺能刺激先天免疫，它与可调节单核细胞数量的 IFN-I 之间存在正向相互作用，有助于增强抗肿瘤免疫反应 。
研究还发现，乳腺癌患者体内 CD14+CD16 + 单核细胞亚群频率显著高于健康对照组，这可能是肿瘤细胞产生的如 IL-10 和 CCL2 等因子调节循环单核细胞所致。而且，由 CD14+CD16 + 单核细胞分化而来的调节性 DC 可诱导 Th2 极化，导致肿瘤免疫耐受。不过，在头颈部鳞状细胞癌、胆管癌和肝细胞癌中，手术前后单核细胞数量会明显下降，这种差异可能与癌症类型有关 。
更重要的是，NACT 后样本中 CD14+CD16 + 单核细胞亚群频率显著降低，紫杉醇治疗组比 4AC 治疗组降低更明显，说明化疗可能通过清除 CD14+CD16 + 促炎细胞亚群发挥作用 。
在 sCD163 方面，患者血清和诱导 sCD163 水平均高于健康对照组，且与 CD14+CD16 + 单核细胞亚群呈正相关。NACT 后 sCD163 水平显著下降，紫杉醇治疗组下降更显著。这可能与 CD163 表面表达上调影响 sCD163 水平有关，同时，强大的促癌细胞因子 TNF-α 可诱导肿瘤细胞表面分子脱落，紫杉醇能降低人原代 PBMCs 中 CD163 和 IL-10 水平 。
综合来看，双阳性单核细胞和血清 sCD163 水平在预测乳腺癌患者 NACT 疗效方面可能具有重要价值，或许可作为潜在指标指导乳腺癌患者的 NACT 治疗，为乳腺癌治疗方案的优化提供了新的方向和理论依据，有望推动乳腺癌治疗领域的进一步发展。
