9 - 氨基米诺环素靶向新冠病毒 PLpro 酶，协同增效抗疫新曙光

为解决新冠治疗药物的局限性问题，美国内布拉斯加大学医学中心的研究人员开展 9-AMN 靶向 SARS-CoV-2 PLpro 酶的研究。结果发现其能抑制病毒复制，与其他药物联用有协同效应。该研究为新冠治疗提供新思路，值得科研人员一读。

　　

美国内布拉斯加大学医学中心（University of Nebraska Medical Centre）药理学与实验神经科学系的研究人员 Kabita Pandey 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “9-aminominocycline potentiates the efficacy of EIDD-1931 and PF332 by targeting the papain like protease enzyme of SARS-CoV-2” 的论文。该论文在抗击新冠病毒（SARS-CoV-2）领域具有重要意义，为开发新型抗新冠病毒药物提供了新的方向和潜在方案。

研究背景

新冠疫情由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）感染引发，其传播迅速、疾病负担重且死亡率高，给全球公共卫生带来巨大挑战。虽然疫苗在减轻 SARS-CoV-2 的严重程度和传播方面有一定效果，但对于孕妇、儿童和有基础疾病的人群，疫苗诱导的抗体保护效果仍存疑。而且现有疫苗主要针对 SARS-CoV-2 的刺突蛋白，而该蛋白频繁突变，这使得探索其他药物开发途径变得十分必要。

研究发现，抑制病毒复制相关的酶，如蛋白酶和聚合酶，有助于减少病毒复制。SARS-CoV-2 复制过程中，3 - 胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CLpro）、木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）和依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）起着关键作用，是抗病毒药物的重要靶点。目前，FDA 批准了两种用于治疗 COVID-19 的药物，Paxlovid?（由辉瑞公司研发，是奈玛特韦（nirmatrelvir）和利托那韦（ritonavir）的组合，其中奈玛特韦抑制 SARS-CoV-2 的 3CLpro 酶，利托那韦作为药代动力学增强剂延长奈玛特韦的作用时间和效果）和 Lagevrio?（默克公司研发的莫努匹韦（molnupiravir），靶向抑制 SARS-CoV-2 的 RdRp 酶） 。然而，Paxlovid? 与多种药物存在相互作用，不适合某些特定健康状况的人群；莫努匹韦虽有疗效，但可能会整合到宿主 DNA 中导致基因突变。此外，目前尚无针对 SARS-CoV-2 PLpro 酶的临床治疗药物，而 PLpro 酶在病毒复制和抑制宿主抗病毒免疫反应中至关重要，且在 SARS-CoV-2 变体中高度保守，是开发持久疗法、降低耐药风险的理想靶点。因此，开展针对 PLpro 酶抑制剂的研究迫在眉睫。

研究方法

1. 体外酶活性测定：分别购买 SARS-CoV-2 特异性的 3CLpro、PLpro 和 RdRp 的酶、缓冲液和底物，按照制造商的方案稍作修改进行酶活性测定。将不同浓度的 9 - 氨基米诺环素（9-AMN）与相应的酶预孵育，再加入荧光标记的底物启动反应，通过荧光测量计算酶活性抑制率。
2. PLpro 酶动力学研究：在不同的 96 孔板中加入 PLpro 和不同浓度的 9-AMN，再添加不同浓度的荧光标记底物启动反应，在不同时间点测量荧光强度，通过非线性回归分析（米氏方程曲线，Michaelis–Menten plot）和双倒数作图法（Lineweaver-Burke plot）来确定酶动力学参数，以评估 9-AMN 对 PLpro 的抑制机制。
3. 细胞活力评估：利用 PrestoBlue?细胞活力试剂盒，在 Calu-3 细胞系中评估 9-AMN 的细胞毒性。将细胞接种在 96 孔板中，加入不同浓度的 9-AMN 孵育，再加入 PrestoBlue 溶液，通过测量吸光度来评估细胞活力。
4. 体外病毒挑战实验：以 Calu-3 细胞为模型，用 SARS-CoV-2 的 Delta 和 Omicron 变体感染细胞，同时加入不同浓度的 9-AMN。感染一定时间后，收集培养上清液，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测病毒载量，计算病毒复制抑制率，并通过免疫荧光分析观察病毒感染情况。
5. 联合体外病毒挑战实验：在感染 SARS-CoV-2 Omicron 变体的 Calu-3 细胞中，分别单独使用 9-AMN、EIDD-1931（莫努匹韦的活性成分，作用于 RdRp）和 PF-332（针对 3CLpro 的活性分子），以及将它们两两组合使用，通过 RT-qPCR 定量病毒载量，利用 Loewe 加法模型和 Chou-Talalay 组合指数（CI）算法评估药物组合的协同效应。
6. 计算研究：使用 Molecular Operating Environment（MOE） 2020.09 和 Amber10:EHT 力场进行计算机模拟研究。准备 PLpro 晶体结构和 9-AMN 分子，进行蛋白质 - 药物对接研究，并分析配体结合模式。
7. 统计分析：采用非参数双尾 t 检验（Kolmogorov–Smirnov）比较两组数据，用单因素方差分析（ANOVA）和 Bonferroni 法进行多重比较，通过双向 ANOVA 和 Bonferroni 事后分析、Fisher-LCD 检验比较分组数据，利用四参数可变斜率 S 型剂量反应模型计算 IC50、CC50 和 EC50 值。

研究结果

1. 9-AMN 对 SARS-CoV-2 PLpro 蛋白水解和去泛素化酶（DUB）活性的抑制作用：在 50 μM 浓度下，9-AMN 能有效抑制 SARS-CoV-2 PLpro 酶 95% 的蛋白水解和 DUB 活性，而其母体米诺环素（minocycline）则无此抑制作用。9-AMN 抑制 PLpro 蛋白水解和 DUB 活性的 IC50 值分别为 4.15 μM 和 4.54 μM，且对 SARS-CoV-2 的 3CLpro 和 RdRp 酶无抑制作用。
2. 9-AMN 抑制 PLpro 酶的机制：酶动力学研究表明，9-AMN 作为混合抑制剂作用于 PLpro 酶。随着 9-AMN 浓度增加，Vmax 降低，且不同抑制剂浓度下的 Km 值不同，Lineweaver-Burke 图也显示出不同的 Km 值，表明其混合抑制特性。
3. 9-AMN 与 SARS-CoV-2 PLpro 的分子对接研究：分子对接研究显示，9-AMN 与 SARS-CoV-2 PLpro 的 Tyr268、Asn267、Glu167 和 Leu162 等氨基酸残基相互作用，且嵌入在蛋白水解和 DUB 位点之间的口袋中，解释了其抑制作用，但还需晶体学研究进一步验证。
4. 9-AMN 在 Calu-3 细胞中对 SARS-CoV-2 病毒复制的抑制作用：体外病毒挑战实验表明，9-AMN 能剂量依赖性地抑制 SARS-CoV-2 Delta 和 Omicron 变体的复制，其对 Delta 和 Omicron 变体的 EC50 值分别为 1.04 μM 和 2.35 μM。6.25 μM 的 9-AMN 可使 Delta 变体感染减少 87%，Omicron 变体感染减少 65%。免疫荧光成像显示，经 9-AMN 处理的感染细胞中，SARS-CoV-2 刺突抗原的荧光强度降低。
5. 9-AMN 对 Calu-3 细胞的细胞毒性：在高达 25 μM 的浓度下，9-AMN 在 48 小时内对 Calu-3 细胞无明显毒性，但在 6.25 μM 时对病毒感染的 Calu-3 细胞有高达 25% 的细胞毒性，不过此时仍有 75% 的感染细胞存活，且这些存活细胞中病毒抗原的荧光强度显著降低。
6. 9-AMN 与 EIDD-1931 和 PF-332 的协同作用：联合体外病毒挑战实验表明，9-AMN 与 EIDD-1931 或 PF-332 联合使用时具有协同效应。9-AMN 与 EIDD-1931 联合的平均协同评分达 17.01，CI 值为 0.46（<1），可使 9-AMN 和 EIDD-1931 的剂量分别降低 4.42 倍和 4.14 倍；9-AMN 与 PF-332 联合的协同评分为 10.03，CI 值为 0.9（<1），可使 9-AMN 和 PF-332 的剂量分别降低 6.83 倍和 2.74 倍。

研究结论与讨论

研究人员发现 9-AMN 是一种有潜力的 SARS-CoV-2 PLpro 酶抑制剂，能有效抑制病毒复制，且对 Delta 和 Omicron 变体均有抑制作用。9-AMN 作为混合抑制剂，通过与 PLpro 酶的特定氨基酸残基结合，抑制其蛋白水解和 DUB 活性。同时，9-AMN 与已批准的抗新冠病毒药物 EIDD-1931 和 PF-332 联合使用时表现出协同效应，可降低单一药物的使用剂量，减少潜在毒性，拓宽治疗窗口，降低耐药风险。

然而，目前的研究仍存在一定局限性。虽然在体外实验中观察到了 9-AMN 的抗病毒效果和协同效应，但细胞培养的结果并不一定能直接转化为体内的实际效果。未来需要通过合适的动物模型进行更多的体外和体内实验，进一步优化给药策略，并进行全面的药代动力学和药效学研究，以确定最佳给药方案，评估其在临床应用中的可行性。此外，还需测试 9-AMN 对其他冠状病毒（如 SARS-CoV-1、MERS-CoV）以及其他呼吸道病毒的抗病毒效果，以确认其对多种呼吸道病毒感染的有效性。

总体而言，这项研究为抗 SARS-CoV-2 药物的研发提供了新的思路和潜在的治疗方案。9-AMN 无论是单独使用还是作为联合治疗的一部分，都展现出了抑制病毒感染、减轻 COVID-19 患者严重并发症（如细胞因子风暴）的潜力，有望为抗击新冠疫情及未来可能出现的冠状病毒感染提供有效的治疗手段。