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为解决脊柱硬脑膜修复中促进组织再生与防粘连的难题，北京航空航天大学等单位的研究人员开展 Janus SIS 用于脊柱硬脑膜修复的研究。结果显示该材料能促硬脑膜再生、抑硬膜外纤维化。推荐阅读，助您把握生物材料修复领域前沿成果。
具有各向异性细胞导向和基于丝的抗粘连涂层的 Janus 脱细胞膜用于脊柱硬脑膜修复
摘要： 像脊柱硬脑膜这类具有各向异性结构的软组织修复，需要使用生物材料来引导组织定向生长，同时尽量减少硬膜外纤维化粘连。在此，研究人员通过基于丝的水凝胶涂层构建了 Janus 小肠黏膜下层（SIS），为脊柱硬脑膜缺损修复提供了模拟细胞外基质的特性和抗粘连性能。研究人员证明，通过水蒸气退火处理在 SIS 内表面制备的丝素蛋白和甲基丙烯酸化丝素蛋白（SilMA）复合微槽水凝胶涂层，具有出色的结构稳定性，与 SIS 基底的附着牢固，能使成纤维细胞呈现定向的细胞形态并产生定向的细胞外基质，具有良好的组织相容性，并能促进巨噬细胞向抗炎表型极化。外表面的甲基丙烯酸化透明质酸和 SilMA 复合涂层作为良好的物理屏障，能有效抵抗蛋白质吸附、细胞和组织粘连，并能减轻纤维化反应。雄性大鼠的脊柱硬脑膜缺损实验表明，Janus SIS 能同时促进硬脑膜再生和抑制硬膜外纤维化。
一、引言
脊柱硬脑膜在保护脊髓、防止脑脊液漏和硬膜外粘连方面起着至关重要的作用。在脊柱外科和神经外科手术中，脊柱硬脑膜缺损导致的脑脊液漏是一种常见的术后并发症，其发生率因手术类型而异，在 4% - 32% 之间。目前，用于脊柱硬脑膜修复的材料较少。临床上常用的替代材料包括动物源性胶原基质（如 DuraGen?）、脱细胞细胞外基质（dECM，如 SIS）和合成补片（如聚乙醇酸），但这些材料存在来源有限、降解速率与组织再生不匹配、炎症反应和纤维化粘连等缺点，限制了它们的临床疗效。重要的是，这些替代材料没有充分考虑脊柱硬脑膜的天然细胞外基质（ECM）特性，无法满足硬脑膜再生的多种需求。脊柱硬脑膜的 ECM 主要由纵向平行的胶原纤维组成，具有各向异性。为了实现结构再生，期望开发具有模拟 ECM 微观结构的材料，以促进组织细胞的定向生长。同时，需要避免在远离组织的另一侧发生蛋白质和细胞的生物积累，以减少硬膜外纤维化粘连的发生。因此，开发仿生 Janus 材料来促进脊柱硬脑膜的结构再生和预防硬膜外纤维化势在必行，这对脊柱硬脑膜的功能恢复具有重要意义。
SIS 作为一种具有代表性的 dECM 材料，由于其固有的生物活性、无免疫原性和可降解性，在软组织损伤修复领域具有不可替代的临床价值。它在降解过程中能缓慢释放转化生长因子 -β、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等生长因子，从而调节宿主细胞的表型和功能，最终促进新组织的形成。然而，SIS 缺乏各向异性结构和抗粘连能力，限制了其在脊柱硬脑膜组织工程中的发展。在这种情况下，在 SIS 膜上制备涂层，不仅能精确促进靶组织细胞的生长，还能对周围组织提供抗粘连性能，有望进一步提高临床疗效。
目前，构建各向异性结构的策略，包括微图案化基底和取向聚合物纤维基质等，得到了广泛应用。由于微图案化基底能在微观尺度上精确控制脊 / 槽的形态和尺寸，因此可以调节细胞行为。研究证明，微图案化基底可以诱导有序的细胞外基质形成，促进 M2 巨噬细胞极化，并加速类似天然组织的再生。水凝胶是一种含水的三维网络，与生物软组织相似。鉴于 ECM 微观结构的重要性以及水凝胶与生物组织的相似性，构建模拟生物组织结构的水凝胶涂层将对人体有益。然而，已开发的水凝胶普遍存在的问题是在生理条件下易溶胀，导致形状快速变形。因此，定制具有各向异性结构、生物相容性和抗溶胀稳定性的微图案化水凝胶涂层是非常有必要的。
在硬脑膜愈合过程中，纤维蛋白的过度沉积、组织细胞（如成纤维细胞 / 肌成纤维细胞）的增殖以及 ECM 成分（如胶原蛋白）的沉积，可能会导致硬膜外纤维化和随后的粘连。人们研究了多种策略来预防硬膜外粘连，如改进手术技术、局部或全身药物治疗以及使用基于生物材料的物理屏障等。透明质酸（HA）是一种高度水化的天然大分子，存在于人体组织中。HA 及其衍生物多年来一直作为抗粘连屏障应用于临床。据报道，HA 的聚阴离子配体效应能抑制成纤维细胞的增殖和迁移，以及术后纤维化相关细胞因子的表达。
丝素蛋白（SF）由于其固有的生物相容性、低免疫原性、优异的机械性能和可调节的生物降解速率，在组织工程、再生医学、临床试验以及商业化医疗器械中发挥着越来越重要的作用。SF 链由结晶区和无定形区交错组成，结晶区富含 β - 折叠和 α - 螺旋结构，无定形区主要为无规卷曲结构。SF 链的分子量（MW）和结晶度，以及不同结构（亲水与疏水）的水行为，会强烈影响 SF 的最终性能（降解性、机械性能、亲水性）。通过控制材料的再生过程（脱胶和溶解）和后处理（甲醇 / 乙醇处理和水蒸气退火处理），可以调节 SF 的 MW 和结晶度。
在这项工作中，为了满足脊柱硬脑膜再生的临床需求，研究人员设计了一种 Janus SIS，其内部为可光固化的 SF - SilMA（SFMA）微槽水凝胶涂层，用于引导细胞 / 组织排列；外部为甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA） - SilMA 水凝胶涂层，用于抵抗细胞粘连，从而同时模拟脊柱硬脑膜促进组织再生和防止硬膜外纤维化的功能。研究人员通过物理化学方法对 SFMA 微槽涂层和 HAMA - SilMA 涂层进行了全面研究，随后使用 NIH3T3 成纤维细胞评估了涂层对细胞行为的体外影响。同时，还对涂层进行了全面的体内组织学评估。研究人员利用 Sprague Dawley（SD）大鼠的脊柱硬脑膜缺损模型，研究了 Janus SIS 在硬脑膜再生和抑制硬膜外纤维化方面的体内性能。
二、结果
2.1 Janus SIS 膜的设计与制备
在本研究中，研究人员通过光固化和微成型技术制备了具有细胞接触引导和抗粘连功能的 Janus SIS（图 1 和补充图 1）。首先，根据之前的研究，研究人员通过层层（LbL）自组装技术将 SFMA 涂覆在 SIS 膜表面。SIS 表面膜上双键的沉积可作为 “桥梁”，用于连接后续的 SFMA 微槽和 HAMA - SilMA 水凝胶涂层（图 1a）。然后，将宽度为 20μm 的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）模板填充 SFMA 溶液，并将 SFMA - SIS 膜覆盖在上述溶液上。在此，引入较高 MW 和结晶度的 SF 有助于微槽形成过程中的结构稳定性和机械抗性（补充图 2 和图 3）。光固化后，SFMA - SIS 膜的内表面装饰有微槽（模拟脊柱硬脑膜 ECM 特征），用于引导细胞排列。在 SFMA - SIS 膜的外表面制备 HAMA - SilMA 亲水涂层，以抵抗蛋白质吸附和细胞粘连，从而最大限度地减少纤维化粘连。为了减少 SFMA 微槽水凝胶涂层的溶胀，研究人员采用 2 分钟的水蒸气退火处理，以诱导 SF 形成 β - 折叠结构（图 1b）。最后，研究人员在大鼠脊柱硬脑膜缺损模型中验证了 Janus SIS 膜促进愈合和抵抗粘连的功效（图 1c）。
2.2 Janus SIS 膜的形态表征
图 2a 展示了在锂苯基（ - 2,4,6 - 三甲基苯甲酰基）膦酸酯（LAP）光引发剂存在下，SilMA、HAMA 和 SilMA 的光聚合反应。研究人员通过扫描电子显微镜（SEM）、3D 光学扫描和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对 SIS、SFMA - SIS 膜、水蒸气退火前后的 SFMA 微槽涂层以及 HAMA - SilMA 涂层的表面形态进行了评估（图 2b）。SEM 和 3D 光学扫描图像结果表明，SIS 表面具有纤维状和多孔结构，且纤维直径不均匀。通过 LbL 自组装沉积 SFMA 后，SIS 表面的纤维和孔隙消失，表面变得光滑。在 SFMA 微槽涂层样品中，表面具有间隔和深度均为 20μm 的微槽，且水蒸气退火后 SFMA 微槽涂层的微观结构没有变化。另一方面，HAMA - SilMA 表面是平坦的。此外，横截面图像进一步证明了 Janus SIS 的不对称性，涂层集中在 SIS 膜的表面，SIS 膜内部保持松散结构，没有过多的 SF 渗出（图 2c）。而且，基于丝的涂层厚度可根据需要进行调整（补充图 4）。
2.3 水蒸气退火对 SFMA 微槽涂层理化性质的影响
先前的研究表明，水蒸气退火对 SF 的理化性质有显著影响。接下来，研究人员首先使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究了 SFMA 微槽涂层的二级结构。如图 3a、b 所示，在未进行水蒸气退火处理和进行 2 分钟水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层光谱中，酰胺 I 区域 1644
和 1639
处的峰对应于无规卷曲（1638 - 1655
）。值得注意的是，进行 30 分钟水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层光谱中，在 1620
处出现了一个峰，表明其二级结构以 β - 折叠（1616 - 1637
）为主。为了进一步确认 SFMA 微槽涂层二级结构的含量，研究人员根据既定程序对 FTIR 光谱的酰胺 I 区域进行了傅里叶自解卷积分析。结果发现，随着退火时间的延长，β - 折叠的含量增加，而无规卷曲和 α - 螺旋的含量同时减少（图 3c、d）。这些结果表明，水蒸气退火过程促进了 β - 折叠的形成，且 β - 折叠的含量可通过处理时间来控制。
在体内植入后，SFMA 微槽涂层在湿润环境中可重新水合为水凝胶状态。因此，研究人员在完全水合后，通过流变学和拉伸实验系统地评估了经过和未经过水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层的机械性能。流变学测试表明，与未经过水蒸气退火处理的涂层相比，经过水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层在 0.1Hz 的固定频率下，储能模量显著增加（约 10 倍），损耗角（tan
）显著降低（图 3e、f）。拉伸应力 - 应变结果表明，经过水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层比未经过处理的涂层具有更高的拉伸强度、断裂应变、杨氏模量和韧性（图 3g、h），拉伸强度从 4.39 ± 0.56 KPa 增加到 12.69 ± 2.06 KPa，断裂应变从 132% 增加到 197%，杨氏模量从 5.1 ± 1.98 KPa 增加到 10.58 ± 0.68 KPa，韧性从 3.32 ± 0.2
增加到 14.74 ± 0.78
。这些结果反映出水蒸气退火处理可以显著提高 SFMA 微槽涂层的机械性能。
研究人员进一步验证了经过和未经过水蒸气退火处理的 SFMA - SIS 上的 SFMA 微槽涂层在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中浸泡 3 天、7 天和 14 天后的结构稳定性。结果显示，经过 2 分钟水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层在整个时间段内都保持了结构稳定性，而未经过处理的 SFMA 微槽涂层在浸泡在 PBS 溶液中后迅速溶胀，在 1 分钟内就完全失去了清晰的微槽结构（图 3i）。研究人员推测，水蒸气退火诱导增加的 β - 折叠可作为交联位点，加强 SF 分子之间的相互作用，从而提高 SFMA 微槽涂层的抗溶胀能力（图 3j）。
2.4 SFMA 微槽涂层与 SIS 基底之间的界面粘附
研究人员使用搭接剪切试验来检测 SFMA 微槽涂层与 SIS 基底之间的界面粘附（图 4a）。SFMA 微槽涂层与 SFMA 修饰的 SIS 基底之间的粘附强度约为 240.77 ± 26.95 KPa，显著高于正常丝修饰的 SIS（137.29 ± 10.57 KPa）和未修饰的 SIS（66.22 ± 9.04 KPa），这可能是由于 SilMA 的双键通过光固化反应在界面处发生聚合（图 4b、c）。同时，随着 SFMA 浓度从 5%（w/v）增加到 7%，粘附强度从 94.81 ± 13.69 KPa 增加到 315.71 ± 11.02 KPa（图 4d、e）。研究人员还评估了经过和未经过水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层与 SFMA - SIS 之间的粘附强度（图 4f、g）。令人印象深刻的是，经过水蒸气退火处理的 SFMA 微槽涂层比未经过处理的涂层具有更高的粘附强度。综上所述，这些结果表明，光固化反应的共价键合和水蒸气处理介导的 β - 折叠的物理相互作用协同增加了 SFMA 微槽涂层与 SIS 基底之间的界面粘附强度。
2.5 基于 HAMA 的涂层的稳定性和抗粘连性能
HA 及其衍生物已被广泛用作抗粘连材料。然而，HA 具有高吸水性，会导致过度溶胀和耐久性不足，限制了其作为可植入装置表面涂层的应用。在本研究中，研究人员在 HAMA 体系中添加 SilMA，以增强基于 HAMA 的抗粘连涂层的性能。FTIR 光谱结果显示，添加 SilMA 后，HAMA 的特征峰发生了显著位移，表明有效形成了 HAMA - SilMA 复合物（补充图 5）。为了研究 SilMA 对界面粘附的影响，研究人员进行了搭接剪切试验。结果表明，HAMA - SilMA 涂层与 SFMA - SIS 基底之间的界面粘附力约为 40 KPa。然而，在未添加 SilMA 的情况下，HAMA 涂层与 SFMA - SIS 之间的粘附强度几乎无法检测到（图 5a、b）。大鼠皮下植入实验结果进一步表明，植入 14 天后，纯 HAMA 涂层出现明显变形和溶胀，并从 SFMA - SIS 基底上脱落，这表明 HAMA 在体内无法长期保持稳定结构。相比之下，添加 SilMA 有效地保持了 HAMA 涂层的结构，防止了变形、溶胀和脱落（图 5c）。非特异性蛋白质的吸附有助于细胞和组织粘连的形成。为了评估添加 SilMA 是否会影响 HAMA 涂层的抗蛋白质吸附效果，研究人员使用荧光标记的 FITC - 牛血清白蛋白（BSA）吸附实验，对未涂层的 SIS 膜、具有 HAMA 涂层或 HAMA - SilMA 涂层的 SIS 膜进行了分析。研究人员通过观察 CLSM 图像的荧光强度和测量 BCA 蛋白含量来确定蛋白质的吸附情况。研究人员发现，具有 HAMA 涂层和 HAMA - SilMA 涂层的 SIS 膜的荧光信号和 BSA 吸附量均显著低于未涂层的 SIS 膜，具有 HAMA 涂层和 HAMA - SilMA 涂层的 SIS 膜的 BSA 吸附量分别为未涂层 SIS 膜的 9.71% 和 14.66%（图 5d - f）。此外，水接触角测试结果显示，涂覆 HAMA - SilMA 和 HAMA 后，水接触角分别从 82.26.87 ± 1.47° 降至 31.87 ± 1.36° 和 23.95 ± 1.07°，这显著提高了未涂层 SIS 膜的亲水性，如图 5g 所示。这些结果表明，添加 SilMA 不会显著影响 HAMA 的亲水性和抗蛋白质吸附效果。
为了实现适当的抗粘连效果，理想的抗粘连生物材料需要有足够的保留时间，一般为 2 - 4 周，以度过粘连形成的整个阶段。在此，研究人员使用体内成像系统（IVIS）测量 FITC 标记的 HAMA 和 HAMA - SilMA 涂层的荧光强度变化，来评估涂层的体内降解情况（图 5h、i）。结果显示，两种涂层的荧光强度均随时间逐渐降低，植入 14 天后，HAMA 和 HAMA - SilMA 涂层的荧光强度分别约为初始荧光强度的 49.83% 和 45.67%，这表明添加 SilMA 不会显著影响基于 HAMA 的涂层的降解行为，且该涂层具有合适的降解速率。
2.6 基于丝的涂层的体外生物学功能
为了评估基于丝的 Janus 涂层对细胞行为的影响，研究人员将 NIH3T3 成纤维细胞接种在未修饰的 SIS、SFMA - SIS、SFMA 微槽表面和 HAMA - SilMA 表面上。培养 3 天后，SIS 和 SFMA - SIS 上的细胞呈随机排列。由于表面拓扑结构的接触引导作用，SFMA 微槽表面上的细胞呈细长形状，并有序生长（图 6a、b）。CCK - 8 测试结果显示，在培养 1 天、3 天和 7 天后，SIS 和 SFMA - SIS 组的细胞增殖率高于 SFMA 微槽表面组，且 SIS 和 SFMA - SIS 组之间没有显著差异（图 6d）。另一方面，在 HAMA - SilMA 涂层表面几乎观察不到细胞，且细胞增殖极少。HAMA - SilMA 涂层表面无细胞粘附，有助于防止相邻组织的不必要接触。
胶原蛋白作为 ECM 的主要成分，通过其定向排列和有序分布，为各向
