整合应激反应中细胞自主、非配体依赖且由 DR5 驱动的凋亡开关新发现

为探究 ISR 细胞死亡调控机制，美国加州大学圣巴巴拉分校的研究人员开展了相关研究。他们发现 ISR 通过细胞内非配体依赖的 DR5 激活诱导凋亡。该成果为理解细胞应激反应提供新思路，推荐科研读者阅读。

　　

美国加利福尼亚大学圣巴巴拉分校（University of California, Santa Barbara）的 Francesca Zappa、Nerea L. Muniozguren 等研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “The integrated stress response engages a cell-autonomous, ligand-independent, DR5-driven apoptosis switch” 的论文。这篇论文在细胞应激反应和细胞死亡调控领域意义重大，为深入理解细胞如何应对压力并决定自身命运提供了关键线索，有望为相关疾病的治疗和干预开辟新的思路。

摘要解读

论文的摘要指出，整合应激反应（Integrated Stress Response，ISR）是细胞应对各种压力、恢复体内平衡的重要信号网络。当细胞无法恢复平衡时，ISR 会促使细胞死亡，清除受损严重的细胞。以往研究表明，在内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）持续应激时，ISR 激酶 PERK 的持续激活会诱导死亡受体 5（Death Receptor 5，DR5）下游的细胞凋亡。本研究通过化学遗传学方法，发现 DR5 从高尔基体发出的信号是 ISR 的重要组成部分，且不局限于 ER 应激。此外，DR5 的激活仅需其表达增加，并不依赖其胞外结构域（Ectodomain，ED）。这些发现揭示了一种由 ISR 控制的通用细胞死亡机制，能清除不可逆损伤的细胞。

研究背景

ISR 是细胞内重要的信号网络，由 GCN2、HRI、PKR 和 PERK 这四种传感器激酶（sensor kinases）调控。不同的应激源会激活相应的激酶，如氨基酸短缺和核糖体碰撞激活 GCN2，血红素缺乏、氧化和线粒体应激激活 HRI，病毒和内源性双链 RNA 激活 PKR，ER 蛋白质稳态失衡激活 PERK 。这些激酶会磷酸化真核起始因子 2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α），抑制细胞内整体的蛋白质合成。但一些含有上游开放阅读框（upstream open reading frames，uORFs）的 mRNA 不受此调控，在 eIF2α 磷酸化时会被选择性翻译，其中包括编码转录因子 ATF4、CHOP 以及 GADD34 的 mRNA。GADD34 能使 eIF2α 去磷酸化，形成负反馈回路，终止 ISR 信号传导，并建立应激记忆。

在正常情况下，ISR 通过重新编程翻译组和转录组来满足细胞需求，恢复体内平衡。然而，当细胞面临严重且持续的应激，无法恢复平衡时，ISR 就会启动细胞凋亡程序，清除受损细胞。在 ER 应激过程中，PERK 和 ER 应激传感器激酶 / 核糖核酸酶 IRE1（Unfolded Protein Response，UPR 的三个调控因子之一）之间的信号相互作用，决定了细胞的适应性反应或死亡结局。PERK 下游的 CHOP 会诱导 DR5 的表达，DR5 属于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）超家族的跨膜死亡受体。在 UPR 的早期适应性阶段，IRE1 会切割 DR5 mRNA 使其降解。但在持续的 ER 应激中，PERK 下游的磷酸酶 RPAP2 抑制促生存的 IRE1 信号，使平衡向促凋亡的 PERK-CHOP 轴倾斜，导致 DR5 激活。此前认为，在 ER 应激时，未折叠蛋白会积累并作为激活配体与 DR5 的 ED 结合，其 ED 中的二硫键重排也有助于 DR5 通过寡聚化激活。

这些现象表明，持续的 ER 应激会引发局部的细胞清除程序。但 eIF2α 磷酸化和 CHOP 诱导是 ISR 的常见输出，这暗示可能存在一种由 DR5 控制的通用 ISR 细胞清除模式。为验证这一假设，研究人员开展了此项研究。

研究方法

1. 细胞处理与诱导：选用 H4 神经胶质瘤细胞（neuroglioma cells）、ARPE19 和 RPE1 非癌细胞系进行实验。使用多种 ISR 诱导剂处理细胞，如用毒胡萝卜素（thapsigargin）诱导 ER 应激并激活 PERK，转染双链 RNA 模拟物聚肌苷酸 - 聚胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，poly I:C）诱导 dsRNA 应激并激活 PKR，用寡霉素（oligomycin）诱导线粒体应激并激活 HRI，用 L - 组氨醇（L-histidinol）模拟营养缺乏并激活 GCN2。同时，使用 ISR 抑制剂 ISRIB、泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK 等进行共处理实验。

2. 基因工程技术：构建稳定表达 FKBP-PKR 的细胞系，通过小分子配体激活该融合蛋白，实现无应激条件下激活 ISR。利用 CRISPR 干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术敲低 DR5 基因表达，用 RNA 干扰（RNA interference）技术敲低 FADD 或 TRAIL 基因表达。构建并转染表达全长 DR5 和缺失 ED 的 DR5 突变体的细胞系。

3. 检测技术：采用定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测 mRNA 水平；蛋白质免疫印迹（immunoblotting）分析蛋白质表达、磷酸化水平和蛋白切割情况；免疫荧光分析（immunofluorescence analyses）观察蛋白的亚细胞定位；流式细胞术（flow cytometry）检测细胞活力和死亡情况；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞内和细胞外 TRAIL 蛋白水平。

研究结果

1. 不同 ISR 诱导应激均导致 DR5 激活：用不同的 ISR 诱导剂处理 H4 细胞 18 小时后，qRT-PCR 检测发现，毒胡萝卜素处理使 DR5 mRNA 上调约 4 倍，poly I:C、寡霉素和 L - 组氨醇处理分别使其上调约 2 倍和 3 倍。蛋白质免疫印迹结果显示，DR5 蛋白水平也相应增加，同时伴随 caspase - 8、caspase - 3 的切割和 PARP1 的裂解，这些都是 DR5 促凋亡活性的体现。用 ISRIB 抑制 ISR 后，DR5 mRNA 上调受到抑制，细胞活力部分恢复，细胞死亡减少。过表达 eIF2α 的磷酸模拟突变体 eIF2α551D 也能诱导 DR5 mRNA 积累，进一步证明 DR5 是由磷酸化 eIF2α 下游的不同 ISR 激酶诱导产生的。

2. 无应激激活 ISR 诱导 DR5 和细胞凋亡：激活 FKBP-PKR 模拟无应激条件下的 ISR 激活，H4 细胞中 DR5 mRNA 和蛋白随时间积累，在 16 小时达到峰值。在 ARPE19 和 RPE1 细胞中也观察到类似现象，且伴随 caspase - 8 切割和 PARP1 裂解等细胞凋亡标志。这表明 DR5 可以在不依赖应激输入的情况下被诱导，启动 ISR 下游的细胞自主凋亡。

3. ISR 下游细胞死亡依赖 DR5：在表达 FKBP-PKR 的 H4 细胞中，用 CRISPRi 敲低 DR5 后，FKBP-PKR 激活时 caspase - 8 和 caspase - 3 的激活显著降低，细胞活力明显恢复。过表达抗凋亡蛋白 BCL-XL 可完全阻断 FKBP-PKR 激活诱导的细胞死亡，表明 ISR 细胞死亡信号通过内源性凋亡途径传导。此外，ISRIB 和 Z-VAD-FMK 处理以及 DR5 基因敲低均能恢复细胞活力，进一步证实 DR5 是 ISR 诱导细胞凋亡所必需的。

4. 无应激激活 ISR 导致 DR5 细胞内激活：检测发现，FKBP-PKR 激活的细胞中 TRAIL mRNA 和蛋白水平均下降，敲低 TRAIL 不影响细胞死亡，用 DR5 中和性 Fc 抗体片段（FcDR5）处理也不能阻止细胞死亡和 caspase 激活，说明 TRAIL 和细胞膜上的 DR5 在 ISR 激活的细胞死亡中并非必需。免疫荧光分析显示，无应激激活 ISR 时，DR5 积累在顺面高尔基体（cis-Golgi apparatus），与 ER 应激诱导剂处理后的定位相似，表明终端 ISR 采用了一种内在、通用、非传统的细胞自主凋亡机制。

5. DR5 激活无需其 ED：构建表达全长 DR5 和缺失 ED 的 DR5 突变体的细胞系，过表达这两种蛋白均导致细胞活力剂量依赖性下降，且激活 DR5 下游分子级联反应的程度相似，均能诱导 caspase - 8、caspase - 3 切割和 PARP1 裂解。两种蛋白都积累在顺面高尔基体并与 caspase - 8 共定位，用布雷菲德菌素 A（brefeldin A）破坏高尔基体结构后，细胞死亡部分受到保护，说明增加 DR5 水平足以在高尔基体膜上原位组装死亡诱导信号复合物（Death-Inducing Signaling Complex，DISC），启动细胞内、依赖 DR5 的细胞自主凋亡程序，DR5 表达本身就足以激活细胞自主的 ISR 细胞死亡开关，无需细胞内配体。

研究结论与讨论

本研究通过多种实验方法证实，终端 ISR 依赖细胞内 DR5 的激活来启动细胞自主凋亡机制，且该过程无需 DR5 的 ED 激活信号。这一结论基于多方面证据：ISR 诱导剂和无应激激活 ISR 均能上调 DR5 并诱导细胞凋亡；ISRIB 可逆转 ISR 诱导的 DR5 上调和细胞死亡；缺乏 DR5 的细胞对 ISR 诱导的细胞死亡更具抗性；DR5 在细胞内激活且积累于顺面高尔基体；缺失 ED 的 DR5 突变体过表达仍能诱导细胞死亡。

ISR 在维持细胞健康中起着关键作用，它需要准确解读应激信息并做出相应反应。终端 ISR 可能通过 eIF2α 下游的通用机制，将细胞不可修复的危急状态信息传递给 DR5，启动促凋亡信号通路（phospho-eIF2α→CHOP→DR5）。研究还发现，过表达 BCL-XL 可完全阻止合成 ISR 激活导致的细胞死亡，表明 ISR 细胞死亡开关优先激活内源性凋亡途径，但细胞中可能存在功能冗余机制来清除无法恢复稳态的细胞。

此外，研究表明 DR5 可通过过表达激活，且在无 ISR 诱导应激时也能激活，这意味着 ISR 细胞死亡开关可能不依赖于特定的应激输入与 DR5 激活的精确匹配，而是当应激持续且达到一定阈值（如 ISR 信号持续时间或强度）时即可启动。虽然不能完全排除其他因素对 DR5 活性的影响，但研究结果支持 DR5 在顺面高尔基体的聚集是 ISR 细胞死亡开关的主要组成部分这一观点。

这项研究揭示了 ISR 调控细胞死亡的通用机制，有助于深入理解 ISR 如何维持组织健康，无论是通过定制的稳态解决方案还是统一的终端反应。这为进一步研究细胞应激反应和细胞死亡调控提供了重要理论基础，也为开发针对相关疾病（如神经病理疾病、癌症等，这些疾病中 ISR 常出现失调）的治疗策略提供了潜在靶点和新思路。