酵母单细胞 mRNA 与细胞器共定位分析的创新利器

为解决酵母中 mRNA - 细胞器共定位分析缺乏有效工具的问题，以色列魏茨曼科学研究所的研究人员开发 EASI-ORC 流程。结果显示其高效准确，能分析多种数据。

　　

以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）的研究人员 Shahar Garin、Liav Levavi 和 Jeffrey E. Gerst 在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “EASI-ORC: A pipeline for the efficient analysis and segmentation of smFISH images for organelle-RNA colocalization measurements in yeast” 的论文。这篇论文在细胞生物学领域，尤其是在研究 mRNA（信使核糖核酸）与细胞器共定位方面具有重要意义，为该领域的研究提供了新的方法和思路，有助于深入理解细胞内 RNA 的定位机制及其对细胞功能的影响。

研究背景

mRNA 的亚细胞分布是所有生命形式的基本现象，mRNA 定位于不同细胞器或其他亚细胞区室，对细胞功能有着显著影响，可能是通过实现这些功能所需蛋白质的局部翻译来达成。研究发现，mRNA 可定位于中心体、不同神经元位点、核膜以及内质网（ER）、线粒体、过氧化物酶体等细胞器 。

在研究细胞内 RNA 定位的众多方法中，单分子荧光原位杂交（smFISH）自问世以来，一直是研究亚细胞 RNA 定位的金标准方法。然而，对 smFISH 产生的图像进行分析，必须准确且一致，才能将数据转化为可量化的格式。随着实验规模的扩大，图像和数据量增多，手动分析变得愈发困难、耗时，且对于细胞器 - RNA 共定位分析而言，人工判断特定 smFISH 信号与细胞器的位置对应关系，既主观又容易出错。

虽然已有许多计算解决方案用于辅助 smFISH 信号识别，但尚无工具能同时促进 RNA 和细胞器的共定位分析。此外，使用计算图像分析的基本挑战在于，如何将图像转化为所有感兴趣区域都清晰定义的形式，例如明确特定像素是属于细胞器、FISH 信号，还是在细胞内或细胞外。为了克服缺乏准确测量酵母中 mRNA - 细胞器共定位软件的问题，研究人员开发了 EASI - ORC（Efficient Analysis and Segmentation of smFISH Images for Organelle - RNA Colocalization）分析流程。

研究方法

1. 酵母细胞图像分割：利用 ImageJ 脚本自动化 YeastMate 插件，对酵母的明场或微分干涉对比（DIC）图像进行细胞分割，将细胞与背景区分开来，产生二进制黑白图像作为细胞掩模。选择识别细胞数量最多的 z 平面并复制，以跟踪不同平面中的每个细胞。

2. 细胞器分割：借助 ImageJ 插件 Trainable WEKA Segmentation，利用机器学习和简单易用的图形界面，让用户为每个实验训练细胞器图像分割模型。训练后的模型应用于图像文件夹，产生统计图，再通过简单阈值处理转化为二进制图像，得到细胞器掩模。

3. 细胞器亚分割：以细胞核标记作为内质网（ER）的邻近标记，通过从 ER 二进制图像中减去细胞核二进制图像得到远离细胞核的 ER 片段（cER）二进制图像，再从总 ER 二进制图像中减去 cER 二进制图像得到 nER 二进制图像，实现 ER 的亚分割。该方法可用于其他细胞器的亚分割，前提是有合适的邻近标记。

4. smFISH 信号识别：选用基于 ImageJ 的 RS - FISH 工具，通过手动确定合适的信号阈值参数，自动化识别 smFISH 探针信号。该工具能利用多平面图像中的三维信息，以亚像素分辨率确定信号位置，并将识别的 RNA 斑点数据保存为表格。

5. RNA - 细胞器共定位解析：利用其他模块产生的掩模图像和斑点数据表，将每个 smFISH 斑点与特定细胞关联，判断其与细胞器的共定位情况。对于亚分割的细胞器，会比较斑点周围两个亚段的平均信号强度来确定共定位。

6. 数据整合与分析：开发基于 Python 的在线工具，对共定位数据进行整合和分析。可通过 mRNA 信号强度、细胞器覆盖率和每个细胞的 mRNA 信号数量进行过滤，生成多种图形和统计分析数据，还能创建合成细胞群体与真实数据对比。

研究结果

1. 酵母细胞图像分割：YeastMate 插件结合自动化脚本，能有效从明场图像中分割出酵母细胞，生成的细胞掩模可用于后续分析。通过选择合适的 z 平面，提高了细胞识别的准确性和一致性。

2. 细胞器分割：Trainable WEKA Segmentation 插件训练的模型，可准确分割细胞器。与深度学习方法 StarDist 对比，在酵母细胞核分割中，二者准确性相当，都能有效识别背景和细胞核信号。

3. 细胞器亚分割：利用邻近标记对 ER 进行亚分割，成功将其分为 nER 和 cER 两个区域。该方法可推广到其他有合适邻近标记的细胞器亚分割情况。

4. smFISH 信号识别：RS - FISH 工具在 EASI - ORC 中能准确识别 smFISH 信号，其自动化过程简单，确定阈值后可应用于多个图像，为共定位分析提供了可靠的数据。

5. RNA - 细胞器共定位解析：EASI - ORC 能准确测量 RNA - 细胞器共定位，与手动分析结果高度相似，但效率更高。例如，对 HSP150 mRNA 与不同细胞器的共定位分析，EASI - ORC 分析结果与手动分析差异极小。

6. 数据整合与分析：开发的在线工具可对 EASI - ORC 产生的数据进行有效过滤和分析，生成多种可视化图形，帮助研究人员深入理解数据特征和相关性。如通过分析不同条件下 SUC2 mRNA 的相关数据，发现其在低葡萄糖诱导下与 ER 的共定位比例增加，mRNA 信号数量也显著增多。

研究结论与讨论

EASI - ORC 为酵母中 smFISH 共定位分析提供了可靠、一致且高效的解决方案。它能对酵母细胞和细胞器进行分割，测量 mRNA - 细胞器共定位，理论上更换细胞分割步骤后，还可用于其他类型细胞。

研究表明，EASI - ORC 的分析结果与手动分析高度相似，但耗时更短、分析的细胞数量更多。它能准确测量生物变化以及 mRNA - 细胞器定位和 mRNA 丰度的差异，如 SUC2 和 OXA1 mRNA 在诱导条件下的变化。此外，研究发现 HSP150 mRNA 与 ER 的共定位水平高于线粒体和过氧化物酶体，且 OXA1 mRNA 与线粒体的共定位比例明显高于 HSP150 mRNA，这些结果都与预期相符。

EASI - ORC 的代码开源，研究人员还提供了详细的用户指南和部分模型，方便其他研究者使用。每个模块可独立工作，便于修改和升级。未来，研究团队希望继续开发 EASI - ORC，增加更多功能，如自动化其他类型细胞分割、实现双斑点共定位分析以及增加统计分析模块的过滤选项等。

总体而言，EASI - ORC 显著提高了 mRNA - 细胞器共定位分析的效率和准确性，降低了技术门槛，促进了 RNA - 细胞器共定位研究的发展，无论是小规模还是大规模的 FISH 实验，都能从中受益，推动了细胞生物学领域对 RNA 定位机制的深入探索。