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为探究 SRBD1 在细胞分裂中的作用，美国范德堡大学医学院研究人员开展相关研究。结果发现 SRBD1 对染色体分离至关重要，失活会引发多种缺陷。该研究为理解细胞分裂机制提供新视角，强烈推荐科研读者阅读。
美国范德堡大学医学院生物化学系（Department of Biochemistry, Vanderbilt University School of Medicine）的研究人员在《自然通讯》（Nature Communications）期刊上发表了题为 “SRBD1 facilitates chromosome segregation by promoting topoisomerase IIα localization to mitotic chromosomes” 的论文。该研究在细胞分裂与基因组稳定性领域意义重大，有助于深入理解染色体分离的分子机制，为相关疾病的研究和治疗提供了新的理论依据。
摘要解读
在细胞分裂过程中，准确的姐妹染色单体分离对维持基因组完整性至关重要，这一过程涉及染色体结构重塑、解链以及与有丝分裂纺锤体的附着等复杂事件。部分事件起始于 S 期，但在有丝分裂期间加速并完成。本研究发现，S1 RNA 结合结构域包含蛋白 1（SRBD1）作为一种组蛋白和核酸结合蛋白，在间期细胞中可防止 DNA 损伤，在复制过程中定位于新生 DNA，在有丝分裂时定位于染色体支架，是染色体分离所必需的。SRBD1 失活会导致微核、染色质桥和细胞死亡。在有丝分裂进入前使 SRBD1 失活，会引发后期失败，拓扑异构酶 IIα（topoisomerase IIα，topo IIα）在有丝分裂染色体上的定位减少，染色体凝聚和解链出现缺陷。相反，在染色体凝聚后，SRBD1 对完成细胞分裂并非必需。值得注意的是，消耗凝聚素 II（condensin II）可通过恢复 topo IIα 的定位，减轻 SRBD1 缺陷细胞的后期缺陷。因此，SRBD1 是一种重要的基因组维持蛋白，对有丝分裂染色体的组织和分离至关重要。
研究背景
维持基因组完整性在细胞分裂过程中极为关键，它依赖于基因组的完整复制以及姐妹染色单体准确分离进入子细胞。这一复杂过程涉及数百种蛋白质的协同作用，且具有高度准确性。一旦出现错误，往往会引发包括癌症在内的多种疾病。
基因组架构在 DNA 复制和染色体分离中起着关键作用。DNA 首先通过组蛋白和非组蛋白 DNA 结合蛋白包装成染色质，这一包装过程在 DNA 复制时会暂时受到干扰。DNA 解旋会产生拓扑变化，如超螺旋，需要拓扑异构酶来缓解扭转应力。其中，II 型拓扑异构酶能够催化去除额外的拓扑障碍，如 DNA 结和连环体，以维持复制叉的移动并完成 DNA 合成。
间期染色质会通过环挤出过程进一步组织成拓扑相关结构域（topologically associated domains，TADs），TADs 可调节基因表达、复制时间和 DNA 修复。拓扑异构酶 IIβ 定位于这些环的基部，虽然能解决环挤出产生的拓扑问题，但也会使这些位点容易发生双链断裂和染色体重排。TADs 之间的长距离折叠，会将染色体压缩并组织成不同区域，影响染色体间和染色体内的相互作用，对基因组稳定性意义重大。
在有丝分裂期间，环挤出对于染色体凝聚和分离同样重要。有丝分裂染色体由围绕非组蛋白蛋白中心支架呈放射状排列的染色质环线性阵列组成。凝聚素复合物和 topo IIα 是该蛋白支架的主要成分，凝聚素 II 通过产生大的环使染色体纵向压缩，凝聚素 I 则在凝聚素 II 的基础上产生嵌套环使染色体横向压缩。凝聚素介导的环挤出会招募并引导 topo IIα 的活性，推动染色体个体化并进一步缩短轴长。这些染色体结构的变化对于承受有丝分裂纺锤体的力量以及在后期分离染色单体至关重要。此前，SRBD1 的多态性与青光眼风险增加相关，且在腺癌患者中发现了 SRBD1 - ALK 融合，但该蛋白的功能在很大程度上仍未被研究。因此，探究 SRBD1 在细胞分裂中的具体作用显得尤为重要。
研究方法
- 细胞培养：研究使用了 U2OS（人骨肉瘤细胞系）、HEK293T（人胚肾细胞系）和 HCT116（人结肠癌细胞系）等多种细胞系，分别在相应的培养基中培养，并定期检测支原体污染。
- RNA 干扰：通过 RNA 干扰技术，使用针对 SRBD1、凝聚素 I 亚基 CAP - H、凝聚素 II 亚基 CAP - H2 和 CAP - D3 等的 siRNA，转染 U2OS 和 HCT116 细胞，以敲低目标蛋白的表达，并通过免疫印迹验证蛋白的消耗情况。
- 内源性标记：利用 CRISPR - Cas9 介导的基因组编辑技术，构建了 HCT116 mAID - mClover - SRBD1 细胞系，通过基因组 PCR 筛选和免疫印迹验证融合蛋白的表达。
- 免疫印迹：制备全细胞裂解物，进行 SDS - PAGE 电泳，然后免疫印迹检测相关蛋白的表达水平，使用 Bio - Rad Stain - Free 总蛋白作为上样对照。
- 细胞同步化和亚细胞分级分离：采用不同的方法将细胞同步化到不同的细胞周期阶段，如用胸苷同步化到 G1 期，用 Ro - 3306 同步化到 G2 期等，并进行亚细胞分级分离，获取可溶性蛋白和染色质相关蛋白组分。
- 蛋白纯化：从 HEK293T 细胞中纯化 Flag - SRBD1 蛋白，经过一系列细胞裂解、核酸酶处理、亲和纯化等步骤获得纯化的蛋白。
- 凝胶迁移实验：进行 SRBD1 的电泳迁移率变动分析，将标记的底物与不同浓度的 Flag - SRBD1 孵育，通过凝胶电泳观察蛋白与核酸的结合情况。
- 免疫共沉淀：转染 GFP - SRBD1 或 GFP - NLS 到 HEK293T 细胞，制备核提取物，利用 GFP - Trap 磁珠进行免疫沉淀，分析共沉淀的蛋白。
- 免疫荧光成像：对间期细胞和有丝分裂细胞进行免疫荧光染色，使用不同的抗体标记 γH2AX、pS4,S8 - RPA 等蛋白，用 DAPI 染色细胞核，通过显微镜成像并分析相关指标。
- 流式细胞术：固定细胞，进行透化处理，用碘化丙啶和 RNase A 染色，分析细胞周期分布；部分样本还会用 pS10 组蛋白 H3 抗体染色，以区分有丝分裂细胞。
- 细胞增殖实验：进行克隆形成实验和短期活力实验，检测细胞的增殖能力和代谢活性。
- 活细胞成像：通过逆转录病毒感染构建表达 H2B - mCherry 的细胞系，对细胞进行不同处理后，使用共聚焦显微镜进行活细胞成像，观察染色体行为和有丝分裂过程。
- 中期染色体长度分析：同步化细胞到 G2 期，处理后收集中期细胞，固定染色后，使用显微镜成像并测量染色体长度。
- RNA 测序：收集转染非靶向或 SRBD1 siRNA 后的 U2OS 细胞的 RNA，制备文库并进行测序，分析基因表达变化。
研究结果
- SRBD1 是一种未被充分表征的组蛋白和核酸结合蛋白，在复制期间富集于新生 DNA：通过 iPOND（新生 DNA 上蛋白质的分离）结合定量质谱技术发现，SRBD1 在新生 DNA 上的相对丰度与复制解旋酶的成分 MCM2 相似，且在整个细胞周期中都与染色质相关。预测的 AlphaFold 结构显示，SRBD1 与铜绿假单胞菌毒素表达蛋白（Tex）和酿酒酵母 Ty6 抑制蛋白（Spt6）结构相似。虽然 SRBD1 缺乏 Spt6 与 RNA 聚合酶 II 相互作用的区域，且 RNA 测序表明其对基因表达影响较小，但 SRBD1 能够结合单链（ss）和双链（ds）DNA 以及 RNA，还能与组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 共免疫沉淀。
- SRBD1 具有基因组维持活性：在 U2OS 细胞中，通过 siRNA 介导的 SRBD1 敲低实验发现，SRBD1 缺陷细胞中 γH2AX 和 RPA 磷酸化水平升高，这是 DNA 损伤和复制应激的标志。同时，细胞中 ssDNA 增加，具有 4n 和大于 4n DNA 含量的细胞积累，出现微核和染色质桥的细胞增多，细胞生长受到抑制，无法形成集落，表明 SRBD1 在防止 DNA 损伤和维持基因组稳定性方面具有重要作用。
- SRBD1 降解导致广泛的后期染色质桥：利用生长素诱导的降解系统（AID2 系统）在 HCT116 细胞中构建了可快速降解 SRBD1 的细胞系。结果显示，SRBD1 降解后，细胞中 γH2AX 水平升高，具有 4n 和大于 4n DNA 含量的细胞比例增加，细胞凋亡迅速诱导。在 G2 期同步化细胞中降解 SRBD1 后，释放到有丝分裂过程中，可观察到大量后期染色质桥和超细微 DNA 桥（UFBs），这表明 SRBD1 在有丝分裂期间促进染色体分离中具有直接作用，且不依赖于其在 S 期的功能。
- SRBD1 在有丝分裂早期发挥作用，防止后期失败：通过稳定表达 H2B - mCherry 的细胞系进行活细胞成像发现，在 G2 期使 SRBD1 失活会导致染色体凝聚、排列正常，但后期姐妹染色单体无法分离，出现大量染色质桥和后期失败的现象。而在 prometaphase（前中期）使 SRBD1 失活，几乎消除了后期失败的表型，染色质桥的严重程度也减轻。这表明 SRBD1 在有丝分裂前期具有关键功能，对建立正确的染色体结构以确保细胞分裂成功至关重要。
- SRBD1 缺陷细胞的有丝分裂纺锤体在后期起始前似乎正常：对固定的有丝分裂细胞进行纺锤体完整性评估，发现 SRBD1 缺陷细胞在后期起始前，纺锤体形成和功能正常，没有观察到单极或多极纺锤体异常，纺锤体长度也没有变化。活细胞成像显示，在后期，正常细胞的染色体被拉向两极，纺锤体伸长，而 SRBD1 缺陷细胞的纺锤体两极在染色质团块塌陷和去凝聚时被拉在一起，部分细胞纺锤体能够伸长并拉动染色体，但仍存在染色质桥。
- SRBD1 通过调节 topo IIα 的定位影响有丝分裂染色体结构：活细胞成像显示 SRBD1 在有丝分裂早期沿凝聚的染色体定位，在固定的中期染色体涂片上也呈现出明显的轴向定位模式，SRBD1 降解后这种定位模式消失，且中期染色体涂片显示染色体异常伸长，提示染色体轴向压缩存在缺陷。iPOND 数据发现 SRBD1 与 topo IIα 在多个实验条件下在新生 DNA 上的丰度具有相关性，进一步研究发现，SRBD1 降解会显著改变 topo IIα 在有丝分裂染色体上的定位，使其在染色体臂上基本缺失，着丝粒积累减弱。消耗凝聚素 II 可显著改善 SRBD1 失活导致的有丝分裂缺陷，恢复 topo IIα 在有丝分裂染色体上的定位，虽然不能完全恢复正常，但能明显改善染色体解缠和分离情况。
研究结论与讨论
本研究鉴定出 SRBD1 是有丝分裂染色体支架的组成部分，对染色体分离至关重要。SRBD1 作为一种 DNA 和组蛋白结合蛋白，在复制期间定位于新生染色质，在有丝分裂时定位于有丝分裂染色体的中心轴，这两个时期和位置都涉及 DNA 拓扑结构和包装的显著变化。SRBD1 在间期可防止 DNA 损伤积累，在有丝分裂早期对塑造有丝分裂染色体、促进 topo IIα 的正确定位起着关键作用。当 SRBD1 在晚期 G2 期失活时，会出现广泛的染色体分离问题，姐妹染色单体无法分离并迅速塌陷去凝聚，大量染色质缠结表明姐妹染色单体连环体持续存在，异常长的中期染色体则显示染色体压缩存在缺陷。
SRBD1 缺陷细胞的后期失败可通过凝聚素 II 的失活部分挽救，这可能是由于恢复了有丝分裂时 topo IIα 的定位。凝聚素和 topo IIα 协同作用，对姐妹染色单体的压缩、去连环以及染色体的个体化至关重要，从而使染色体能够在后期进行分离。虽然目前尚不清楚同时失活凝聚素 II 和 SRBD1 如何恢复 topo IIα 的定位，但这表明这些蛋白质之间存在复杂的关系，最终决定了姐妹染色单体在分离前是否能正确解缠。
此外，SRBD1 与核酸和组蛋白的相互作用可能通过促进染色质结构和 DNA 拓扑结构的变化，招募 topo IIα 到有丝分裂染色体上，完成姐妹染色单体的解缠。虽然不能排除 SRBD1 在后期促进有丝分裂纺锤体正确作用的可能性，但多项证据表明，SRBD1 主要是通过影响 topo IIα 介导的染色体去连环来发挥作用。在没有 SRBD1 的情况下，大量 DNA 缠结的持续存在可能会阻止染色体分离，进而阻碍纺锤体的正常运动。
SRBD1 在间期和有丝分裂期都具有重要功能，它在整个细胞周期中都定位于染色质，在复制细胞中富集于新生 DNA，此时染色质正在重新组装，拓扑异构酶正在缓解扭转应力。失活 SRBD1 会导致 DNA 损伤和复制应激的特征，最终使细胞在 G2 期发生细胞周期检查点依赖性停滞。
总之，该研究揭示了 SRBD1 在染色体分离中的关键作用，为深入理解细胞分裂过程中基因组稳定性的维持机制提供了重要线索，也为相关疾病的研究和治疗开辟了新的方向。未来还需要进一步研究 SRBD1 在 S 期和有丝分裂期的具体作用机制，以及它与其他相关蛋白之间的相互作用关系。
