多参数抗衰老 CRISPR 筛选揭示 BAF 在蛋白质合成调控中的关键新作用

为探究 NGPS 发病机制及寻找治疗靶点，剑桥大学医学研究中心的研究人员开展多参数抗衰老 CRISPR 筛选研究。结果发现 43 个可挽救 NGPS 细胞表型的基因，揭示 BAF 在蛋白质合成调控中的作用。推荐科研人员阅读，助力早衰症研究。

　　

来自剑桥大学医学研究中心（Cambridge Institute for Medical Research）的 Sophia Y. Breusegem 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “A multiparametric anti-aging CRISPR screen uncovers a role for BAF in protein synthesis regulation” 的论文。这篇论文在早衰症研究领域意义重大，为理解早衰症的发病机制和寻找潜在治疗靶点提供了新的方向。

论文摘要指出，早衰症（Progeria syndromes）是一类极为罕见且无法治愈的过早衰老疾病，它重现了大多数衰老特征。研究人员通过全基因组、多参数的 CRISPR 筛选，鉴定出 43 个可挽救与早衰症相关的多种细胞表型的基因。该筛选在患有内斯特 - 吉列尔莫早衰症综合征（Néstor-Guillermo Progeria Syndrome，NGPS）男性患者的成纤维细胞中进行，这些患者的 BAF 基因存在纯合 A12T 突变。筛选出的基因在蛋白质合成、蛋白质和 RNA 转运以及破骨细胞形成等过程中显著富集，并在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）全生物体模型中得到验证。研究还证实，BAF A12T 突变会破坏蛋白质合成的速率和保真度，这可能是患者过早衰老的原因之一。该研究彰显了多参数全基因组抑制筛选在识别增强细胞对早衰耐受性的基因方面的强大作用，有助于深入理解早衰症相关细胞功能障碍的生物学机制。

研究背景

早衰症是一种极为罕见的疾病，它模拟了许多生理衰老的特征，患者会在远早于正常年龄时就出现脱发、脂肪代谢障碍、心血管功能障碍和骨骼功能障碍等症状。许多早衰症是由核膜（Nuclear Envelope，NE）相关蛋白的突变引起的。比如，经典的哈钦森 - 吉尔福德早衰症综合征（Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS）是由编码核纤层蛋白 A 和 C 的 LMNA 基因突变导致的。而 NGPS 则是由编码 10 KDa 蛋白屏障 - 自整合因子（Barrier-to-autointegration factor，BAF）的 BANF1 基因中第 12 位丙氨酸到苏氨酸的隐性氨基酸取代（p.Ala12Thr）引起的。

BAF 能形成二聚体，与 DNA、核纤层蛋白以及内核膜含 LEM 结构域的蛋白质（如 Emerin）结合。通过这些相互作用，BAF 在有丝分裂后核膜的重新形成和核膜破裂修复等过程中发挥关键作用 。NGPS 患者会遭受多种与衰老相关的疾病，其中最严重影响他们生活质量的是骨骼功能障碍，表现为骨质疏松和严重的骨骼变形 。与 HGPS 相比，NGPS 的特征还未被充分了解，其背后的分子机制也才刚刚开始被揭示。因此，为了识别与 NGPS 相关的基因和途径，以及寻找潜在的治疗靶点，研究人员开展了这项研究。

研究方法

1. 细胞培养与表型分析：研究使用了来自两名 NGPS 男性患者（NGPS1 和 NGPS2）的永生化成纤维细胞，以及年龄匹配的野生型（Wild Type，WT）永生化成纤维细胞。通过电子显微镜、免疫荧光和蛋白质印迹等技术，对细胞的核膜形态、蛋白质表达和定位等表型进行分析，以确定 NGPS 细胞与 HGPS 细胞及 WT 细胞的差异。
2. 多参数 CRISPR 筛选：设计了基于显微镜的多参数 CRISPR 筛选方法，旨在识别删除后能挽救多种 NGPS 细胞表型的基因。筛选的表型包括 Emerin 从细胞核到细胞质的错位、核变形增加、间期核膜破裂频率增加以及微核形成频率增加。通过构建稳定表达 Cas9 的 WT 和 NGPS 成纤维细胞系，并对不同的 CRISPR 系统进行测试和优化，最终选择了 cr/tracrRNA 系统进行全基因组筛选。
3. 验证筛选与基因功能分析：对初步筛选出的基因进行验证筛选，通过对 3 个独立实验的重复验证，确定了 43 个高可信度的 “命中” 基因。对这些基因进行基因本体分析，以确定它们在生物学过程中的富集情况。同时，通过 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术在秀丽隐杆线虫模型中研究这些基因对 NGPS 相关表型的影响。
4. 蛋白质合成相关分析：进行 RNA 测序（RNA sequencing，RNA-Seq）分析，以确定野生型细胞与 NGPS 细胞中差异表达的基因。使用点击化学标记的蛋氨酸类似物 L - 高炔丙基甘氨酸（L-homopropargylglycine，HPG）掺入实验，测量新生蛋白质合成速率。通过双荧光素酶错译测定法评估蛋白质合成过程中的错误率。

研究结果

1. NGPS 成纤维细胞的独特表型：与 HGPS 成纤维细胞相比，NGPS 成纤维细胞显示出明显不同的表型。通过电子显微镜观察到 NGPS 细胞存在严重的核膜异常，包括深褶皱和核膜起泡，但核周边没有明显的异染色质丢失。NGPS 细胞的增殖速率与 WT 细胞相当，且没有出现 HGPS 细胞常见的层粘连蛋白 B1 下调、DNA 双链断裂积累以及核质运输缺陷（以 Ran 蛋白为报告分子）等现象。不过，NGPS 细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p21 的表达有所增加。
2. 多参数 NGPS 筛选确定的 “命中” 基因：通过全基因组 CRISPR 筛选，研究人员确定了 112 个在基因敲除后能使 NGPS 表型 “正常化” 的基因，再加上在三个个体表型中排名前 15 的 18 个基因，共 130 个基因进入验证筛选。最终，在验证筛选中确认了 43 个高可信度的 “命中” 基因。基因本体分析显示，这些基因在翻译、蛋白质和 RNA 转运以及破骨细胞发育等生物学过程中显著富集，与患者的表型高度相关。
3. “命中” 基因对蛋白质合成的影响：RNA-Seq 分析表明，NGPS 细胞中与 RNA 加工和翻译调控相关的基因存在差异表达。HPG 掺入实验显示，NGPS 细胞的蛋白质合成速率显著高于 WT 细胞和 NGPS 校正细胞，过表达 BAF A12T 的野生型成纤维细胞的蛋白质合成速率也高于表达 BAF WT 的细胞。此外，双荧光素酶错译测定法显示 NGPS 细胞在蛋白质合成过程中的错误率增加。通过 siRNA 敲低筛选出的 41 个 “命中” 蛋白后发现，许多与蛋白质合成无直接关联的基因敲低后，也能不同程度地降低 NGPS2 细胞中的 HPG 掺入，其中 21 个基因达到显著水平。使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide，CHX）和西维因（silvestrol）处理 NGPS1 和 NGPS2 细胞后，Emerin 重新富集到细胞核中。
4. “命中” 基因在秀丽隐杆线虫模型中的作用：利用携带 baf-1 (G12T) 突变的 NGPS 秀丽隐杆线虫模型进行研究，发现该模型重现了患者细胞中的一些表型，包括核膜中 Emerin 的丢失、畸形核的积累以及核糖体基因的失调。研究还观察到，NGPS 线虫的核仁面积增大，与 NGPS 细胞中的现象一致。通过 RNAi 敲低筛选出的 32 个基因（存在秀丽隐杆线虫同源物），发现敲低 RPS-1（人类 RPS3A 的同源物）、lis-1（PAFAH1B1）、vps-16（VPS16）和 smu-1（SMU1）基因可抑制 gfp::lmn-1; baf-1 (G12T) 动物的致死性。

研究结论与讨论

本研究通过基于显微镜的 CRISPR/Cas9 全基因组筛选，在 NGPS 患者来源的成纤维细胞中识别出多个可挽救早衰表型的基因，揭示了 BAF A12T 突变导致细胞功能障碍的相关途径，为这种无法治愈的早衰综合征确定了潜在的治疗靶点。研究表明，调节核输入可能对 NGPS 细胞的核膜组织和功能有积极影响。筛选出的与破骨细胞发育相关的基因，如 LRRK1 和 PAFAH1B1，其敲低可改善 NGPS 细胞表型，提示它们可能与 NGPS 患者的严重骨质疏松和骨溶解有关 。

此外，研究发现蛋白质合成途径的调节对 NGPS 细胞和线虫的表型有重要影响。BAF A12T 突变与蛋白质合成速率增加和翻译错误率上升相关，抑制蛋白质合成可改善 NGPS 细胞的核膜异常。这支持了当前的假设，即过早衰老和生理衰老中观察到的细胞稳态丧失可能通过相似的机制发生 。虽然目前没有 NGPS 的小鼠模型，但已有研究表明易错的蛋白质合成会导致小鼠出现类似 NGPS 患者的早衰特征，这进一步强调了调节蛋白质合成可能是改善 NGPS 患者表型的潜在治疗策略。

不过，本研究也存在一定的局限性。由于无法获得原发性 NGPS 细胞，只能使用永生化成纤维细胞进行研究，这限制了一些功能实验的开展，如细胞复制寿命和迁移实验。未来的研究可以进一步探索蛋白质翻译与核膜完整性之间的联系，以及筛选出的基因在体内的具体作用机制。一旦有了 NGPS 的小鼠模型，将有助于更深入地研究这些基因对疾病表型的影响，为开发有效的治疗方法提供更坚实的基础。

总的来说，这项研究为早衰症的研究开辟了新的方向，为理解疾病机制和开发潜在治疗方法提供了有价值的线索，有望在未来为早衰症患者带来新的希望。