利用 CpG 负载突变体攻克大肠杆菌生产流感 NP 的细菌 RNA 安全难题

为解决大肠杆菌生产流感 NP 时细菌 RNA 带来的安全及一致性问题，华中农业大学的研究人员开展相关研究。他们发现 NP 结合细菌 RNA 增强免疫反应，且开发的 NP 突变体可解决安全问题。该成果为通用流感疫苗研发提供新方向，值得一读。

　　

华中农业大学的研究人员在《npj Vaccines》期刊上发表了题为 “Addressing unexpected bacterial RNA safety concerns of E. coli produced influenza NP through CpG loaded mutant” 的论文。该论文在流感疫苗研发领域意义重大，为开发通用流感疫苗提供了新的思路和策略，有望解决现有疫苗存在的问题，增强对流感病毒的防控能力。

研究背景

流感病毒（Influenza virus）一直是全球公共卫生的重大威胁，甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）作为其中的代表，传染性极强，极易引发大规模的流感疫情。目前，季节性流感疫苗主要通过诱导针对血凝素（HA）免疫显性头部区域的中和抗体来发挥作用。然而，HA 频繁发生抗原性变化，使得已建立的免疫保护对新出现的流感毒株效果有限。因此，开发一种能针对多种毒株、基于不同流感毒株保守抗原的通用流感疫苗迫在眉睫。

核蛋白（Nucleoprotein，NP）作为流感病毒的保守抗原之一，含有能诱导细胞免疫反应的保守免疫显性 CD8 T 细胞表位，可有效清除被病毒感染的细胞。重组 NP 蛋白通常在大肠杆菌（E. coli）中生产，具有较高的免疫原性，在无佐剂的情况下也能诱导针对不同流感病毒的完全或部分保护。而且，通过合理设计，如将 NP 抗原制成纳米颗粒，添加佐剂，或者与流感病毒的其他保守抗原（如 M2 蛋白的胞外域（M2e）、M1 和 HA 的保守区域）联合使用，能进一步提高 NP 疫苗的保护效力和保护范围。

尽管 NP 在流感疫苗研发中前景广阔，但此前人们并不清楚在大肠杆菌中生产的 NP 是否会结合细菌 RNA，以及这些 RNA 对 NP 免疫反应的影响。此外，重组 NP 蛋白在无佐剂情况下的高免疫原性也引发了研究人员的好奇，这一系列未知促使研究人员开展了此项研究。

研究方法

1. 质粒构建：以 A/PR/8/34 (H1N1) 的基因为模板，扩增全长 NP 基因并克隆到 pET28a 表达载体，构建 pET28a-NP 表达质粒。通过定点 PCR 诱变技术，构建了精氨酸残基突变的质粒 pET28a-NPAla 和 pET28a-NPGly。同时，此前已构建好表达流感 M2 蛋白胞外域串联三体融合 RbSoc 基因的质粒 pRbSoc-3M2e。

2. 重组蛋白表达与纯化：将上述表达质粒分别转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 中，用 1 mM 异丙基 -β-D-1 - 硫代半乳糖苷（IPTG）在 28°C 诱导 4 小时表达蛋白。收集菌体，经高压细胞破碎仪裂解，离心取上清过滤后，利用 HisTrap 柱和 Hi-Load 16/60 Superdex 200 柱进行纯化。为去除 NP 结合的核酸，用 DNase I、RNase A 或 Benzonase 核酸酶处理，再纯化去除核酸酶。采用 SDS-PAGE 和牛血清白蛋白（BSA）作为标准测定蛋白浓度，使用鲎变形细胞溶解物（LAL）内毒素定量试剂盒检测内毒素水平。

3. 其他实验方法：运用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白；纯化 NP 结合的大肠杆菌 RNA；利用荧光素酶报告基因检测（Luciferase reporter assays）分析 NP 结合的细菌 RNA 对 NF-κB 和 IRF3 的激活作用；通过凝胶迁移实验（Gel-shift assay）测定蛋白与 RNA 或 DNA 的结合活性；选用 6 - 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行免疫和流感病毒攻毒实验；对小鼠肺组织进行组织病理学分析（Lung histopathology）；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的抗体；运用激活诱导标记（AIM）分析和细胞内细胞因子染色（ICCS）实验检测抗原特异性 T 细胞反应；使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），生存曲线的统计显著性通过对数秩（Mantel-Cox）检验确定。

研究结果

1. NP 与 3M2e 共给药增强免疫反应：研究人员将在大肠杆菌中生产的 NP 和 3M2e 蛋白经鼻内给予小鼠，对照组分别给予相同剂量的 NP、3M2e 或 PBS。结果显示，3M2e/NP 组在末次免疫 2 周后，对 A/PR/8/34 (H1N1) 和 A/SD/12/2019 (H3N2) 的攻毒提供了 100% 的保护，而单独的 NP 和 3M2e 仅提供 40% 的保护。从体重变化来看，3M2e/NP 组也优于单独给药组。进一步检测发现，3M2e/NP 组血清中 M2e 特异性 IgG、CD4 T 细胞水平以及支气管肺泡灌洗液中黏膜 IgG 和 IgA 抗体水平显著高于 3M2e 组，表明 NP 对 3M2e 具有佐剂活性，共给药能增强 3M2e 特异性免疫反应。

2. NP 对 3M2e 的佐剂活性依赖于结合的大肠杆菌 RNA：研究人员发现纯化的重组 NP 和 3M2e 蛋白内毒素水平相似，排除了 NP 佐剂活性源于内毒素污染的可能。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定 NP 蛋白含有大量细菌核酸，经 DNase I 和 RNase A 处理证实为 RNA。NF-κB-Luc 和 IRF3-Luc 双荧光素酶报告基因检测表明，NP 结合的细菌 RNA 能剂量依赖性激活 NF-κB 和 IRF3。用 Benzonase 核酸酶去除 NP 结合的细菌 RNA（NP-Tx）后免疫小鼠，结果显示 NP-Tx 组和 3M2e/NP-Tx 组的 NP 特异性和 M2e 特异性抗体水平、细胞免疫反应以及 BALF 中抗原特异性 IgG 和 IgA 水平均显著低于未处理组，且 NP 和 NP-Tx 的寡聚状态相同，说明 NP 结合的细菌 RNA 具有佐剂活性，是增强 3M2e 特异性免疫反应的主要原因。

3. NP 结合的大肠杆菌 RNA 增强 NP/3M2e 疫苗效力：对末次免疫 14 天后的小鼠用致死剂量的 H1N1/PR8 病毒攻毒，3M2e/NP 免疫组小鼠体重无明显变化，其他组小鼠出现不同程度体重下降。NP-Tx 组生存率为 20%，NP 组为 40%，3M2e/NP-Tx 组为 80%，3M2e/NP 组为 100%，PBS 免疫组小鼠全部死亡。肺组织病理学分析显示，NP-Tx 组小鼠肺损伤严重，3M2e/NP-Tx 组损伤较轻，3M2e/NP 组肺组织形态正常。用 H3N2 流感病毒攻毒也得到类似结果，表明 NP 结合的大肠杆菌 RNA 具有佐剂活性，能增强 NP/3M2e 疫苗的保护效力。

4. 含 CpG1826 且无细菌 RNA 结合活性的 NP 突变体可作为通用流感疫苗靶点：由于 NP 结合的大肠杆菌 RNA 批次间差异大，可能引发全身炎症和不良免疫病理反应，研究人员构建了 NP 突变体（NPmut），使其丧失细菌 RNA 结合活性但能结合合成佐剂 CpG1826。实验表明，NPmut 几乎完全丧失大肠杆菌 RNA 结合活性，能剂量依赖性结合 CpG1826。免疫实验显示，NPmut 单独免疫诱导的 NP 特异性抗体反应可忽略不计，共递送 CpG1826 显著提高了 NP 特异性抗体水平。流感病毒攻毒实验表明，NPmut/CpG1826 免疫组小鼠的生存率和肺组织病理损伤情况均优于 NPmut 组，说明 NPmut 解决了大肠杆菌 RNA 污染的安全问题，可共递送抗原和佐剂诱导相似免疫反应，是通用流感疫苗开发的潜在靶点。

5. 共递送 CpG1826 增强 NPmut/3M2e 效力：将 3M2e 与 NPmut 或 CpG1826 负载的 NPmut 混合免疫小鼠，结果显示共递送 CpG1826 显著提高了 NP 特异性和 M2e 特异性 IgG 水平，增强了抗原特异性细胞免疫反应和黏膜体液免疫反应。攻毒实验表明，CpG1826 负载的 3M2e/NPmut 组小鼠体重下降不明显，对 A/PR/8/34 (H1N1) 和 A/SD/12/2019 (H3N2) 流感病毒的免疫保护作用增强，说明 CpG1826 不仅增强 NP 特异性免疫反应，还提高 M2e 特异性免疫反应。

研究结论与讨论

这项研究深入剖析了在大肠杆菌中生产的重组 NP 的免疫原性。研究发现，大肠杆菌生产的 NP 蛋白免疫原性高主要是因为生产过程中结合了细菌 RNA，这些 RNA 显著增强了 NP 特异性免疫反应。然而，不同生产批次中细菌 RNA 含量的差异会给疫苗开发带来安全性和一致性方面的问题。细菌 RNA 作为病原体相关分子模式（PAMP），虽能激活先天免疫反应，但剂量依赖性的免疫刺激作用可能导致高剂量时引发全身炎症和不良免疫反应。

为解决这些问题，研究人员开发了 NP 突变体 NPmut，它缺乏天然 NP 的 RNA 结合活性，但可负载合成佐剂 CpG1826。实验结果表明，CpG1826 负载的 NPmut 诱导的免疫反应与大肠杆菌 RNA 结合的 NP 相当，在消除细菌 RNA 污染安全风险的同时保持了免疫原性。而且，CpG1826 负载的 3M2e/NPmut 对流感病毒攻毒提供了更强的完全保护，凸显了其作为通用流感疫苗有力组成部分的潜力。

该研究成果为通用流感疫苗的研发提供了重要的理论依据和实践指导。通过明确大肠杆菌生产的 NP 中细菌 RNA 的作用及风险，并提出有效的解决方案，为未来开发更安全、有效的通用流感疫苗开辟了新途径，有望在流感防控领域发挥重要作用，助力全球公共卫生事业的发展。