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为探究牛膝低极性成分抗炎潜力，湖南中医药大学研究人员开展 α- 菠菜甾醇（α-spinasterol）抗炎研究，发现其可抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症，为开发抗炎药物提供依据，推荐科研读者一读。
在医学研究的广阔领域中，炎症就像一个隐藏在暗处的 “小怪兽”，悄悄影响着我们的健康。它可不是个简单的角色，大多数疾病的发生和发展都有它在背后 “捣鬼” ，像癌症、糖尿病、关节炎，还有心血管疾病、阿尔茨海默病、神经系统疾病等等。巨噬细胞作为免疫系统的 “卫士”，在炎症反应中起着关键作用，它会在遇到像脂多糖（LPS）这样的 “敌人” 时，释放出肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白细胞介素 - 6（IL-6）等炎症因子来对抗外敌，但要是炎症反应过度，就会对身体造成伤害。
之前的研究发现，牛膝（Achyranthes aspera L.）在传统中医里应用广泛，能治疗跌打损伤、风湿关节痛、痢疾等多种疾病。而且牛膝不同极性部位对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞（一种小鼠巨噬细胞系）的一氧化氮（NO）产生有抑制作用，其中低极性部位的抑制活性最为显著。可过去对牛膝化学成分的研究大多集中在皂苷和甾体酮上，对于那些不容易被水提取出来的低极性成分，它们的抗炎潜力还不太清楚。所以，为了深入了解牛膝的化学成分，挖掘它在临床应用上的更多可能，湖南中医药大学的研究人员开启了一段探索之旅。
他们的研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，论文题目是《α-spinasterol isolated from Achyranthes aspera L. ameliorates inflammation via NF-κB and Nrf2/HO-1 pathways》 。这项研究发现，从牛膝低极性部位分离出的 α- 菠菜甾醇（α-spinasterol）能抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症，其作用机制可能与抑制核因子 -κB（NF-κB）通路、激活核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）通路，以及减少炎症因子的过度释放有关。这一发现为牛膝及其活性成分 α- 菠菜甾醇在治疗相关炎症性疾病方面提供了重要的理论依据，就像是为开发新型抗炎药物找到了一把 “钥匙” 。
研究人员在开展研究时，用了好几种关键技术方法。他们通过柱色谱法和半制备高效液相色谱法（Semi-Prep HPLC）从牛膝低极性部位分离化合物；利用核磁共振技术（NMR）来鉴定化合物的结构；采用高效液相色谱法（HPLC）测定 α- 菠菜甾醇的含量；运用细胞活力检测（CCK8 法）评估 α- 菠菜甾醇对 RAW264.7 细胞的毒性；借助 Griess 法检测 NO 释放量；使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞上清液中 TNF-α、IL-6 和前列腺素 E2（PGE2）的水平；通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）分析相关蛋白的表达情况。这些技术方法就像一套 “组合拳”，帮助研究人员一步步揭开 α- 菠菜甾醇的神秘面纱。
下面来看看具体的研究结果：
化合物鉴定
研究人员首次从牛膝低极性部位分离出了三种化合物，通过与文献数据对比，确定它们分别是 α- 菠菜甾醇（1）、7,8 - 二氢菠菜甾醇（2）、22,23 - 二氢菠菜甾醇（3）。在分离过程中，他们使用了对低极性化合物亲和力高的 ODS 柱，还在乙腈中加入少量异丙醇作为流动相，优化了分离效果。通过对化合物 1 的核磁共振数据（1H-NMR 和 13C-NMR）分析，结合文献对比，最终确定它就是 α- 菠菜甾醇，另外两种化合物也通过类似的方法得以鉴定。
α- 菠菜甾醇的含量测定
研究人员用 HPLC 法测定了不同月份收获的牛膝中 α- 菠菜甾醇的含量。结果发现，4 月份牛膝地上部分还未长出时，α- 菠菜甾醇含量达到峰值 0.0157% ；而在 9 月和 10 月的结果期，含量最低，只有 0.005% 。从 4 月到 12 月，α- 菠菜甾醇的平均含量为 0.0091% 。这表明牛膝中 α- 菠菜甾醇的含量在春季和冬季相对较高，为牛膝的种植和采收提供了重要参考，就像告诉农民伯伯什么时候去收获，能得到更多有价值的 α- 菠菜甾醇。
α- 菠菜甾醇对 RAW264.7 细胞活力的影响
研究人员用 CCK8 法检测 α- 菠菜甾醇对 RAW264.7 细胞活力的影响。结果显示，在 1 - 10 μM 浓度范围内，α- 菠菜甾醇对细胞没有毒性，但浓度超过 10 μM 时，细胞黏附性会下降，出现更多脱落现象。这就好比给 α- 菠菜甾醇的使用剂量划定了一个安全范围，在这个范围内使用，细胞才 “乐意接受” 。
α- 菠菜甾醇对 RAW264.7 细胞中 NO 产生的影响
研究人员用 LPS 诱导 RAW264.7 细胞分化为 M1 型细胞，产生促炎细胞因子，并以此建立炎症模型。然后用不同浓度的 α- 菠菜甾醇或阳性药物地塞米松（Dex）进行干预。结果发现，α- 菠菜甾醇在 1 - 5 μM 范围内对 NO 释放有剂量依赖性抑制作用，5 μM 时抑制效果最佳。在显微镜下观察，LPS 刺激后的细胞变得形态异常，体积增大、出现伪足，而用 α- 菠菜甾醇（5 μM）和 Dex（10 μg/mL）处理后的细胞体积更正常，伪足也减少了。这说明 α- 菠菜甾醇能有效抑制炎症反应，让细胞 “恢复正常” 。
α- 菠菜甾醇对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞中促炎细胞因子产生的影响
研究人员进一步检测了 α- 菠菜甾醇对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞产生 TNF-α、IL-6 和 PGE2 的影响。实验结果显示，模型组细胞上清液中这些炎症因子的水平比对照组显著升高，说明炎症模型建立成功。而用 α- 菠菜甾醇和 Dex 处理后，这些炎症因子的浓度明显降低，再次证明了 α- 菠菜甾醇的抗炎作用。
α- 菠菜甾醇对 COX-2 和 5-LOX 蛋白表达的影响
COX-2 和 5-LOX 是炎症过程的重要调节因子，抑制它们的表达被认为是预防炎症性疾病的有效策略。研究人员通过 Western blot 研究发现，模型组中 COX-2 和 5-LOX 蛋白表达显著升高，而 α- 菠菜甾醇和 Dex 处理后，这两种蛋白的表达明显降低。这表明 α- 菠菜甾醇可能通过抑制 COX-2 和 5-LOX 的表达来发挥抗炎作用，就像给炎症反应 “踩了刹车” 。
α- 菠菜甾醇对 p-IKKB、p-NF-κB 和 p-IκBα 蛋白表达的影响
NF-κB 是调节活化巨噬细胞中促炎介质产生的重要转录因子。研究发现，与对照组相比，模型组中 p-IKKB、p-NF-κB 和 p-IκBα 蛋白表达显著增加，而用 α- 菠菜甾醇处理后，这些蛋白的表达明显降低。这说明 α- 菠菜甾醇可能通过抑制 NF-κB 信号通路相关蛋白的激活来发挥抗炎作用，和阳性药物 Dex 一样有效。
α- 菠菜甾醇对 Nrf2、HO-1 和 NQO1 蛋白表达的影响
Nrf2 是细胞抗氧化应激反应的关键转录因子，HO-1 和 NQO1 是其下游抗氧化因子。研究人员通过 Western blot 分析发现，模型组中 Nrf2、NQO1 和 HO-1 蛋白表达比对照组显著降低，而 α- 菠菜甾醇处理组中这些蛋白的表达明显上调。这表明 α- 菠菜甾醇可能通过激活 Nrf2、HO-1 和 NQO1 蛋白的表达来调节细胞氧化还原状态，发挥抗炎活性，和 Dex 组一样能使相关蛋白水平显著增加。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：α- 菠菜甾醇具有显著的抗炎活性，它能抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症，作用机制与调节花生四烯酸代谢途径、NF-κB 核转位和 Nrf2 信号通路有关。这一研究成果意义重大，不仅让我们对牛膝的化学成分和药理作用有了更深入的了解，也为开发基于 α- 菠菜甾醇的抗炎药物提供了理论依据。未来，或许可以根据这一研究成果，开发出更安全、有效的抗炎药物，为那些受炎症性疾病困扰的患者带来新的希望。同时，也为传统中药牛膝在现代医学中的应用开辟了新的道路，让古老的中药在现代医学舞台上焕发出新的光彩。
