线粒体自噬关键酶CaEch1调控油茶炭疽病菌生长发育及致病力的机制研究

本研究针对油茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）致病机制不明的问题，通过基因敲除和功能分析揭示了线粒体β-氧化酶CaEch1通过调控线粒体自噬（mitophagy）影响真菌生长、分生孢子形成、附着胞发育及致病力的分子机制。研究人员发现CaEch1-GFP可作为线粒体自噬标记物，其缺失导致线粒体形态异常和毒力显著下降，为开发靶向线粒体自噬的新型杀菌剂提供了理论依据。

　　

油茶作为中国特有的木本油料作物，在生态保护和乡村振兴中具有重要战略地位。然而由Colletotrichum camelliae引起的炭疽病严重威胁油茶产量和品质，目前缺乏有效的抗病品种或防治手段。线粒体自噬作为选择性清除受损线粒体的关键过程，在真菌发育和致病中发挥重要作用，但其在C. camelliae中的调控机制尚属空白。

为解析这一科学问题，浙江农林大学的研究团队聚焦线粒体β-氧化酶CaEch1（与稻瘟菌MoEch1同源），通过构建基因敲除株ΔCaech1和回补株ΔCaech1-C，结合荧光标记、透射电镜和Western blot等技术，系统研究了该基因在真菌生物学过程中的功能。研究发现，定位于线粒体的CaEch1通过调控线粒体自噬影响真菌生长发育——ΔCaech1突变体表现出菌落缩小（较野生型减少约30%）、分生孢子产量降低（仅为野生型的15%）及附着胞畸形率升高（达50%以上）等表型缺陷。致病性实验证实，该突变体在油茶叶片上的病斑面积显著减小，表明CaEch1是维持真菌毒力的关键因子。

研究创新性地发现CaEch1_1-29-GFP可作为线粒体自噬标记物：在氮饥饿条件下，该融合蛋白会转移至液泡并被降解，同时线粒体外膜蛋白Porin的免疫印迹证实了自噬发生。透射电镜观察显示ΔCaech1突变体中线粒体呈现异常囊泡化结构，揭示了CaEch1在维持线粒体形态中的重要作用。

主要技术方法包括：1）农杆菌介导的基因敲除（ATMT）和回补株构建；2）激光共聚焦显微技术追踪CaEch1-GFP亚细胞定位；3）透射电镜观察线粒体超微结构；4）Western blot检测线粒体自噬标志物降解；5）离体叶片接种测定致病性。

研究结果具体表现为：

1. CaEch1的鉴定与表达特征

   系统发育分析显示CaEch1与Colletotrichum fructicola的CfEch1亲缘最近（99%相似性），其编码蛋白含有保守的Enoyl-CoA hydratase结构域。qRT-PCR检测发现侵染过程中CaECH1表达量较0 hpi升高6-40倍。

2. 基因功能验证

   通过Southern blot和RT-PCR验证获得ΔCaech1纯合突变体。表型分析显示突变体在PDA培养基上菌落直径显著减小，分生孢子长度缩短且产量锐减。

3. 致病性缺陷

   离体接种实验表明ΔCaech1致病力显著降低，病斑扩展速度较野生型延迟。进一步观察发现突变体分生孢子萌发率下降，且形成的附着胞出现明显形态异常。

4. 线粒体定位与自噬调控

   
   ，证实其线粒体定位特性。氮饥饿诱导实验（图7）中CaMts-GFP在液泡内积累，Western blot检测到融合蛋白降解，建立了线粒体自噬监测体系。

该研究首次阐明CaEch1通过调控线粒体自噬影响C. camelliae致病力的分子机制，不仅为理解炭疽病菌致病机理提供了新视角，其建立的CaEch1_1-29-GFP标记系统更为真菌线粒体自噬研究提供了重要工具。研究成果发表于《Phytopathology Research》，为开发靶向线粒体能量代谢的新型杀菌剂奠定了理论基础，对保障油茶产业可持续发展具有重要应用价值。