编辑推荐：
为明确 EV-E 对山羊的致病性及在中国山羊群体中的感染情况，南阳师范学院等单位的研究人员开展山羊感染 EV-E 的研究，发现中国山羊感染 EV-E4，且该病毒或致呼吸道疾病。推荐阅读，助您了解动物病毒新动态。
在动物的病毒世界里，有一种叫肠道病毒 E（Enterovirus E，EV-E）的家伙，一直以来都让科学家们感到困惑。它以前被叫做牛肠道病毒，在健康动物和生病动物身上都曾出现过。EV-E 是一种单链正义 RNA 病毒，它的基因组包含一个独特的开放阅读框，两边分别是 5’和 3’非翻译区（Untranslated region，UTR）。这个开放阅读框能编码一个多聚蛋白前体，之后会被切割成四种结构蛋白（VP1、VP2、VP3 和 VP4）和七种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D）。根据衣壳蛋白的序列分析，EV-E 又被分为五个基因型（EV-E1 到 EV-E5） 。
它在全球的牛群中广泛分布，亚洲、欧洲、美洲都有它的踪迹。而且这家伙 “不挑食”，除了牛，还能从羊、山羊、马、鹅、负鼠、鹿等动物身上分离出来。不过，它在这些动物身上到底会搞出什么 “破坏”，致病性和毒力到底有多强，大家都不太清楚。在动物身上，EV-E 有时和肺炎、腹泻、流产这些症状 “搅和” 在一起，但又不能确定它就是这些疾病的 “罪魁祸首”。
在中国，之前已经从牛身上分离出了 EV-E，也从山羊身上分离出了肠道病毒 F（Enterovirus F，EV-F）。在泰国，曾从山羊的粪便样本里分离出 EV-E，可当时并没有记录山羊有没有出现什么临床症状。在中国，EV-E 对山羊的致病性还是个未知数，山羊自然感染 EV-E 的情况也从未有过报道。
在河南等地，农户们常常把牛和山羊一起饲养，牲畜交易也很频繁。这就不禁让人担心，EV-E 会不会在山羊群体里悄悄传播呢？毕竟一些不明原因的呼吸道和肠道疾病，已经给当地的山羊养殖场带来了不小的经济损失。于是，为了弄清楚这些问题，来自南阳师范学院河南省动物疾病诊断与综合防控工程技术研究中心等单位的研究人员展开了一项重要研究，相关成果发表在了《BMC Veterinary Research》期刊上，论文题目是 “Enterovirus E infections in goats with respiratory disease”。
研究人员为了找到真相，用了不少关键技术方法。他们先是收集样本，从生病的山羊、同养殖场健康的山羊以及不同养殖场健康的山羊身上采集了肺样本、鼻拭子和血液样本 。然后进行细菌和病毒的分离，通过特定的方法看看样本里有没有细菌和病毒。接着用电子显微镜观察，瞧瞧有没有可疑的病毒粒子。还运用 PCR/RT-PCR 技术检测常见的病原体，要是没找到目标，就专门针对牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV，也就是 EV-E）进行筛查。另外，他们还做了病毒中和试验，看看血清里有没有能对抗病毒的抗体，最后对病毒的基因序列进行分析 。
下面就来看看他们都发现了什么吧。
病原体分离
研究人员先对样本进行细菌分离，在培养皿上接种生病组山羊的肺样本，24 小时后，在麦康凯琼脂平板和营养琼脂平板上出现了圆形菌落。经过检测分析，发现这些菌落里有枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌。而三个组的血液样本接种后，都没有菌落生长。
接着进行病毒分离，把处理后的鼻样本、肺样本和血清样本接种到牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney cells，MDBK）上。结果发现，生病组的 6 个肺样本里，有 2 个在感染 24 小时后就出现了细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），另外 2 个（1 个鼻样本和 1 个血清样本）在传代 3 次后，36 小时也出现了 CPE。健康组和对照组的样本都没有出现 CPE。出现 CPE 的细胞变得皱缩、变圆，边缘模糊，还会聚集、漂移。
电子显微镜观察 BEV 粒子
为了确定是什么病毒在捣乱，研究人员用电子显微镜观察那些出现 CPE 的细胞上清液。嘿，还真发现了病毒粒子！在 2 个肺样本、1 个鼻样本和 1 个血清样本的接种物里都看到了，这些病毒粒子是均匀的球形，直径大约 30 纳米。
PCR 检测病原体
研究人员用 PCR 技术对三组的所有样本进行检测，想看看有没有常见的山羊呼吸道传染病病原体，结果啥都没发现。不过，这些病毒粒子的特征和 BEV 很像，于是他们就用 BEV 的特异性引物进行检测。这一测，发现生病组 12 个养殖场的山羊都 “中招” 了。肺样本、鼻样本和血液样本里 BEV 的阳性率分别是 83.3%（5/6）、51.5%（35/68）和 33.8%（23/68） 。
进一步分析发现，鼻样本的阳性率在公山羊和母山羊之间没什么明显差别，但不同年龄的山羊差别就大了。6 个月以下的山羊阳性率最高，6 - 12 个月的次之，12 个月以上的最低。血液样本也是类似的情况，而且所有血液阳性的山羊，鼻样本也都是阳性的，但有 12 只鼻拭子阳性的山羊，血液样本却是阴性的。健康组和对照组的鼻样本和血液样本都没有检测到 BEV。
四株 BEV 分离株的基因型特征和系统发育分析
研究人员成功测定了四株 BEV 的完整基因组序列，它们的长度在 7435 - 7446 个核苷酸之间。通过和数据库里其他肠道病毒的基因组序列对比，发现这四株病毒的 VP1、P1 和多聚蛋白基因，在核苷酸水平上和其他肠道病毒的相似度在 35.3% - 80.4%、40.2% - 79.3% 和 49.5% - 82.0% 之间；在氨基酸水平上，相似度在 38.4% - 87.1%、42.9% - 88.7% 和 51.4% - 91.6% 之间 。
通过系统发育分析，这四株病毒和 EV-E4 亚型的分离株聚在了一起，和中国的 EV-E4 分离株 BEVGX1901 关系最近，平均氨基酸同一性高达 91.4%。而且经过 RDP 分析，这四株病毒都没有发生重组事件。
中和抗体滴度
在生病组的 68 份血清样本里，45 份 PCR 检测为阴性的样本里，有 17 份存在针对 EV-E 的中和抗体，滴度在 1:64 到 1:512 之间；23 份 PCR 阳性的样本里，只有 3 份有中和抗体，滴度分别是 1:4、1:4 和 1:8。健康组和对照组的血清样本里都没有检测到中和抗体。
从这次研究的结果来看，研究人员首次在中国发现患有严重呼吸道疾病的山羊感染了 EV-E。通过 PCR、测序和病毒分离等研究方法，发现这些分离株和 EV-E4 属于同一分支，但在核苷酸和氨基酸水平上，和最接近的菌株还是有很大差异。这就像是发现了一个新的 “敌人”，它可能就是导致山羊呼吸道疾病的重要病原体。
在讨论部分，研究人员提到，虽然之前在中国也有从山羊身上分离出其他肠道病毒的报道，但这次发现的 EV-E 感染还是头一遭。年龄似乎会影响山羊对 EV-E 的易感性，而且 EV-E 很可能就是这次呼吸道疾病爆发的 “元凶”。考虑到 EV-E 在环境里很稳定，能通过粪口途径传播，而且山羊和牛生活在同一片区域，EV-E 很容易在它们之间 “跑来跑去”。
这次研究意义重大。它不仅让我们认识到 EV-E 对山羊健康的威胁，也提醒我们在反刍动物的贸易、运输和养殖过程中，要加强防控措施，比如研发疫苗、筛选药物，防止 EV-E 进一步传播，给养殖业带来更大的损失。同时，也为后续研究 EV-E 在其他动物，甚至人类身上的传播风险提供了重要线索，毕竟 EV-E 还有潜在的人畜共患病风险，关乎到人和动物的共同健康。
