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为解决慢性 HBV 感染难以治愈的问题，南非威特沃特斯兰德大学研究人员开展用 Anc80L65 表达 apri - miR 抑制 HBV 基因表达的研究。结果显示该载体单剂量给药安全且能持久抑制病毒。推荐阅读，探索乙肝治疗新希望。
乙肝（Hepatitis B virus，HBV）感染在撒哈拉以南非洲、东亚和东南亚地区十分常见，是一个严重的全球性健康问题。据估计，全球约有 3 亿慢性乙肝病毒携带者，他们面临着肝硬化和肝癌等严重并发症的风险。尽管有有效的预防性疫苗，但乙肝感染人数仍在上升，因持续感染导致的死亡人数也在增加。
目前，治疗慢性乙肝感染的药物，如干扰素 - α 衍生物、核苷和核苷酸类似物等，虽能有效抑制病毒复制，但很难实现持久治愈。这主要是因为乙肝病毒复制过程中产生的共价闭合环状 DNA（cccDNA）非常稳定，它不仅是病毒蛋白表达的模板，还参与前基因组 RNA（pgRNA）的合成，而现有的药物难以清除 cccDNA。此外，cccDNA 转录调控机制复杂，其编码的乙肝 X 蛋白（HBx）在病毒基因转录和复制中起着关键作用，这也增加了治疗的难度。因此，开发新的、更有效的抗乙肝疗法迫在眉睫。
在这样的背景下，来自南非威特沃特斯兰德大学健康科学学院传染病与肿瘤研究所抗病毒基因治疗研究小组的 Njabulo Ziphezinhle Mnyandu 等人，在《Virology Journal》期刊上发表了题为 “Long - term inhibition of Hepatitis B virus gene expression by a primary microrna expressing ancestral adeno - associated viral vector” 的论文。他们发现，表达人工初级微小 RNA（apri - miR）的祖先腺相关病毒（Anc80L65）载体，单剂量给药就能安全且持久地抑制乙肝病毒基因表达，这为慢性乙肝感染的功能性治愈带来了新希望。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是构建携带特定基因序列的质粒，用于生产自我互补腺相关病毒（scAAV）；然后使用标准方法在 HEK293T 细胞中包装和繁殖 scAAV，并通过定量 PCR（qPCR）进行纯化和滴定；接着在培养细胞（如 HepG2 - hNTCP 和 Huh7 细胞系）和乙肝转基因小鼠中进行实验，通过 ELISA、Luciferase 测定、免疫组化染色、RT - qPCR 等方法检测乙肝病毒基因沉默效果、转基因表达情况、免疫反应以及肝毒性 。
下面我们来详细看看研究结果：
scAnc80 载体在培养细胞中介导 HBV 基因敲低
研究人员通过限制酶切图谱分析确认了用于 AAV 生产的质粒完整性。为评估 scAnc80 对体外 HBV 基因表达的影响，他们在转导表达单顺反子或多顺反子抗 HBV 或抗 HCV 的 apri - miR 的 scAAV 之前，用 psiCHECK - HBx 或 pCH - 9/3901 转染 Huh7 细胞。结果发现，转导后 48 小时，与对照组相比，scAAV2 miR - 31/5、scAAV2 miR - 31/5,8,9、scAnc80 - 31/5 或 scAnc80 miR - 31/5,8,9 处理的细胞中，海肾荧光素酶活性降低，这证实了 miR 能特异性靶向 HBx 序列。而且，携带多顺反子抗 HBV apri - miR 的载体表现优于携带单顺反子 apri - miR 的载体。在转染 pCH - 9/3901 后再转导 scAAV 的 Huh7 细胞培养上清液中，HBsAg 的测量结果也证实了这一点。
为更贴近人类乙肝感染模型，研究人员用 MOI 为 10 的 HBV 感染 hNTCP - HepG2 细胞系，再用 MOI 为 10?的 scAAV 感染。ELISA 结果显示，与阴性对照相比，scAAV 给药 48 小时后，HBsAg 浓度降低。此外，感染表达 apri - miR 的 scAAV2 和 scAnc80 的 hNTCP - HepG2 细胞中，分泌的 HBV 颗粒、HBV RNA 和 HBcAg 水平均降低，进一步验证了载体对 HBV 的抑制效果 。虽然 scAnc80 载体降低 HBV 水平的效果在统计学上不显著，但这些数据表明 scAnc80 能在体外转导细胞并降低 HBV 基因表达。
scAnc80 给药在体内介导长期转基因表达
为证实 scAAV 给药后乙肝转基因小鼠中 RNAi 途径的激活，研究人员在小鼠接受 AAV 后 1 个月或 12 个月，对肝脏匀浆提取的 RNA 进行 Northern blot 杂交分析。他们用与向导序列 5、8 或 9 互补的探针检测成熟 miR。结果发现，在所有接受携带 pri - miR 31/5 或 pri - miR 31/5,8,9 的 scAAV 处理的小鼠中都检测到了向导 5 序列，且在两个分析时间点都有一定丰度。正如预期，向导 8 序列仅在接受携带多顺反子 pri - miR 31/5,8,9 的 scAAV 处理的小鼠提取物中检测到，而向导 9 序列由于产生水平低，在接受表达 miR - 31/5,8,9 的 scAAV 的小鼠中未检测到。同时，还观察到代表未加工的 pri - miR 或 pre - miR 的高分子量条带。结合 scAAV 基因组在肝脏 12 个月的稳定性，这些结果表明 scAnc80 载体能实现令人瞩目的长期肝脏转基因表达，单剂量 AAV 注射一年后仍可检测到。
scAnc80 在转基因小鼠中介导 HBV 基因下调
研究人员给乙肝转基因小鼠注射抗 HBV 的 scAAV 或载体对照，以评估 scAnc80 降低体内 HBsAg 的能力。在 12 个月的实验期间定期进行 ELISA 分析，结果显示，接受携带抗 HBV apri - miR 的 scAAV 的小鼠，其 HBsAg 显著且持续下降约 80% - 90%，scAnc80 和 scAAV8 载体携带 apri - miR 的效果相似，从载体给药后 2 周开始，HBsAg 浓度就持续降低至 12 个月。
对循环 HBV 颗粒当量的定量分析表明，注射表达抗 HBV apri - miR 的载体 1 个月后，病毒颗粒显著下降，scAnc80 和 scAAV8 载体在 1 个月时降低病毒颗粒的效果相似，且在 12 个月内 HBV 载量持续下降，两组小鼠的 HBV VPEs 没有显著差异。
对注射 scAAV 后 1 个月或 12 个月处死的小鼠肝脏样本进行免疫组化检测 HBcAg，结果显示，接受抗 HBV apri - miR 的小鼠肝内 HBcAg 水平明显低于对照组。与培养细胞的观察结果一致，携带多顺反子抗 HBV apri - miR 的 scAnc80 和 scAAV8 载体比携带单顺反子 apri - miR 的载体表现更好。1 个月时，携带三聚体 apri - miR 的载体使 HBcAg 降低约 50%，高于单体 apri - miR 的 35%；12 个月时，所有携带抗 HBV apri - miR 的 scAAV 使 HBcAg 降低超过 95%。此外，AAV 感染后 1 个月和 12 个月测定 HBV RNA 水平，发现 HBV 转录本显著减少，这进一步验证了 scAnc80 载体对 HBV 转录本的靶向作用 。这些结果表明 scAnc80 能介导长期的 HBV 基因抑制。
炎症反应标志物不受 scAnc80 给药的影响
为量化促炎细胞因子（IL - 6、IL - 10、IL - 12p70、IFN - γ、MCP - 1 和 TNF - α）的血清浓度，研究人员在 scAAV 给药 6 小时后进行 CBA 分析。结果显示，除 MCP - 1 外，接受这些载体的小鼠组中所有细胞因子的浓度与注射盐水的小鼠相似。虽然抗 HBV pri - miR 表达的 scAAV8 使 MCP - 1 有适度增加，但对 scAnc80 载体来说并不显著，且与先前使用这些 pri - miR 的研究结果矛盾，因此不能归因于 pri - miR 的表达。同时，用聚（I：C）作为免疫原刺激时，除 IFN - γ 和 IL12p70 外，大多数细胞因子升高。对肝脏组织匀浆提取的 RNA 进行分析，发现注射盐水或 scAAV 的小鼠中，IFN - β 及其相关的 IFIT - 1 和 OAS - 1 基因的转录水平相似，而聚（I：C）诱导了显著的 IFIT - 1 表达，但 IFNβ 和 OAS - 1 没有类似变化。这些结果表明 scAnc80 给药不会在小鼠中诱导促炎反应。
给予 scAnc80 不会诱导肝损伤
研究人员在 AAV 注射后 1 个月或 12 个月，对小鼠肝脏组织进行组织学评估。H&E 染色显示，注射 scAAV 的小鼠组和注射盐水的小鼠组都有轻度炎症，无法确定炎症来源与 scAAV 感染有关。Sirius red 染色显示，接受 scAAV 或盐水的小鼠均无组织纤维化迹象。测量 ALT 活性发现，接受 scAAV 或盐水的小鼠血清中 ALT 活性相似，且都在正常范围内（<100 U/L）。此外，注射 scAAV 或盐水的小鼠体重相似，且所有小鼠体重正常，无生理不适迹象，这表明给予 scAnc80 不会诱导肝损伤。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：scAnc80 载体能够有效且安全地抑制乙肝病毒基因表达，在培养细胞和乙肝转基因小鼠中都展现出了良好的效果，单剂量给药后能实现长达 12 个月的抑制作用，且没有明显的炎症反应和肝毒性。
在讨论部分，研究人员指出，目前慢性乙肝的治疗方案存在不足，基因治疗方法为改善治疗带来了希望。他们使用的 scAnc80 载体能高效地将抗 HBV 的 apri - miR 递送至肝脏，并持续抑制 HBV 基因表达。这种长期沉默 HBV 基因表达的机制可能与 AAV 基因组形成的高分子量串联体有关，这些串联体高度持久，可能是长期治疗效果的原因。
安全性是开发人类治疗方法的重要考虑因素，该研究表明 scAnc80 载体在有效抑制 HBV 基因表达的剂量下，不会引起明显的炎症反应和肝损伤，具有良好的安全性。此外，AAV 载体具有多种优点，如通用性强、生物安全性好、能高效感染乙肝复制的肝细胞等，scAnc80 载体作为一种新型载体，展现出了治疗慢性乙肝感染的潜力 。
然而，该研究也存在一些局限性，比如缺乏 Anc80L65 载体转导原代人肝细胞的证据，研究中未检测 HBeAg 水平，且 HBsAg 检测方法的线性范围有限。尽管如此，这项研究为慢性乙肝感染的治疗提供了新的方向，未来结合 RNAi 激活剂和其他抗 HBV 药物的联合治疗方案，可能会为消除 HBV 带来更现实的方法，有望实现慢性乙肝的治愈，这对于全球众多乙肝患者来说，无疑是一个振奋人心的消息，也为后续的研究和临床治疗奠定了重要基础。
