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为解决噬菌体生产难题，加拿大国家研究委员会等机构的研究人员开展无细胞表达系统用于噬菌体生产和工程的研究。结果表明该系统有潜力，能加速噬菌体研发。推荐阅读，助您了解前沿技术，把握科研新方向。
在微生物的奇妙世界里，噬菌体（一种专门感染细菌的病毒）正逐渐成为对抗耐药菌的有力武器。随着抗菌药物耐药性问题日益严峻，许多传统抗生素失去了往日的威力，人们急需寻找新的治疗方法。噬菌体因其特异性强、能在感染部位繁殖等优点，受到了广泛关注。然而，想要让噬菌体发挥作用，高效的生产和精准的工程改造是关键。但目前的噬菌体生产过程困难重重，就像在布满荆棘的道路上前行。
传统的体内蛋白质生产依赖宿主细胞，不仅耗时久，还得考虑宿主的生长环境和生理状态，每次生产都要经过细胞收获、蛋白纯化等繁琐步骤，就像一场漫长又复杂的旅程。而噬菌体生产更是挑战多多，繁殖时间长，有时需要好几天，还容易受培养基和宿主生长动力学的影响；生产用的宿主得是无致病性、特征明确的，还不能有潜在的前噬菌体污染；生产出来后，还得去除内毒素，这一过程不仅效率参差不齐，还会导致噬菌体效价降低、感染性改变；此外，缺乏符合规范的生产设施，体内工程改造噬菌体不仅耗时，还面临转基因生物许可的难题。所以，开发新的噬菌体生产和工程改造平台迫在眉睫。
为了解决这些难题，来自加拿大国家研究委员会人类健康治疗研究中心等机构的研究人员，在《Microbial Cell Factories》期刊上发表了题为 “Cell-free expression system: a promising platform for bacteriophage production and engineering” 的论文。他们发现，无细胞表达系统（Cell-free expression systems，CFES）就像一把神奇的钥匙，为噬菌体的生产和工程改造带来了新希望。这一系统有望成为个性化噬菌体治疗的生物合成平台，在对抗耐药菌感染的战斗中发挥重要作用。
研究人员在这项研究中主要用到了以下几个关键技术方法：首先是细胞提取物的制备技术，通过优化细菌宿主的生长条件、收获条件等多个环节，获取高质量的细胞提取物；其次是无细胞噬菌体合成（CFBS）技术，精心调配反应混合物的成分，为噬菌体的组装提供良好环境；此外，还运用了多种分析和检测技术，如监测蛋白表达、分析噬菌体效价等，以评估实验效果。
下面来看看研究的具体成果。在细胞提取物制备方面，研究人员像一群精细的工匠，对每一个环节都进行了深入研究。在宿主生长条件上，他们发现不同的培养基和培养条件对蛋白质生产影响巨大。比如，2x 酵母提取物胰蛋白胨（2xYT）培养基因营养丰富常被选用，添加磷酸盐能稳定 pH 值、减少磷酸酶活性，额外补充葡萄糖等碳源可增强 ATP 的生成和再生。对于大肠杆菌（E. coli）宿主，在其生长的对数中期添加异丙基 -β-D-1 - 硫代半乳糖苷（IPTG），能增加 T7 RNA 聚合酶的产量，减少后续无细胞蛋白合成（CFPS）过程的添加剂成本和复杂性。温度对宿主生长也很关键，虽然大肠杆菌的标准生长温度是 37°C，但 30°C 下制备的细胞提取物与线性 DNA 模板结合时，产生的蛋白质是 37°C 时的三倍，这是因为 30°C 提取物中 RecD 蛋白减少，降低了线性 DNA 模板的降解。
在收获条件上，研究发现翻译机器在细菌生长的指数中期最为活跃，所以这一时期是收获细胞的最佳时机。不过，收获时的离心力也有讲究，过高的离心力会对细菌细胞造成压力。研究人员通过实验比较了不同的离心速度和时间，发现 10,000 x g 以上的离心速度对细胞提取物的活性影响不大。
在洗涤缓冲液方面，S30A 缓冲液是常用的选择，它的成分会影响蛋白质的稳定性和活性。比如，镁和钾盐的形式不同，缓冲能力就不一样，谷氨酸盐形式的缓冲能力更强，能更好地稳定 pH 值。而且，洗涤次数对提取物的生产力影响不大，大多数实验室选择洗涤三次。
细胞裂解是获取细胞内功能成分的重要步骤，研究人员尝试了多种方法。压力式裂解系统（如法国压榨机）常用于大规模细胞提取物制备，通过施加压力裂解细胞，最近一些研究使用 10,000 - 15,000 PSI 的较低压力也能成功制备提取物。非压力式裂解技术，如珠磨、珠涡旋和珠击打，利用陶瓷或玻璃珠来裂解细胞，成本效益高且重复性好。超声处理利用超声波能量裂解细胞，但要注意控制能量输入，避免蛋白质变性和细胞裂解不完全，研究人员通过优化超声参数，找到了不同样本体积的最佳能量输入值。冻融法通常与其他裂解方法结合使用，通过冰晶体破坏细胞膜。化学裂解则利用酶（如溶菌酶）或洗涤剂破坏细胞壁，比如溶菌酶辅助超声处理（LAS），能有效提高噬菌体的产量。
细胞裂解后的处理也很重要。澄清步骤能去除不溶性物质和碎片，不同的澄清方法和离心速度会影响提取物的质量和后续实验效果。径流反应可以降解内源性 DNA 和 mRNA，促进 mRNA 与核糖体的解离，但不同细菌菌株的最佳反应时间和温度不同。透析是一个可选步骤，用于去除可能干扰转录和翻译的小分子。储存细胞提取物的方法有很多，如冻干、液氮速冻后储存于 - 80°C 等，不同的储存方法适用于不同的应用场景。
在宿主菌株的选择上，大肠杆菌凭借多年的研究积累和优化的实验方案，成为无细胞表达系统中常用的宿主。但近年来，一些替代宿主如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、谷氨酸棒杆菌（C. glutamate）和纳豆芽孢杆菌（V. natriegens）也受到了关注，它们的细胞提取物内毒素水平较低，但在重组蛋白产量方面还需要进一步优化。
反应混合物和操作也是研究的重要部分。在无细胞噬菌体合成中，反应混合物就像一个精心调配的 “魔法药水”，为噬菌体的组装提供必要的成分。DNA 模板有线性 DNA、质粒和基因组 DNA（gDNA）等多种类型，质粒因其稳定性好常被选用，但线性 DNA 也可以通过一些方法（如添加含 χ 位点的短 dsDNA 序列或 Gam 蛋白）来提高稳定性。提取噬菌体 gDNA 时，要选择合适的方法，确保 DNA 的质量。能量系统是反应持续进行的关键，目前有 PANOx、PANOx - SP、cytomim、肌酸磷酸（CP）、PURE 系统和 3 - 磷酸甘油酸（3 - PGA）等多种能量系统可供选择，每种系统都有其优缺点，研究人员会根据实验需求进行优化选择。此外，反应混合物中还包含缓冲液、氨基酸、离子等多种成分，它们的浓度和配比都会影响实验结果。
在噬菌体基因组复制方面，研究人员探索了多种方法来优化噬菌体的生产和工程改造。比如，利用细胞 - free 小 DNA（CF - sDNA）技术，通过靶向 mRNA 上的核糖体结合位点（RBS），下调相关蛋白的表达，实现对噬菌体基因组的调控。在 T7 噬菌体的研究中，这种方法成功降低了噬菌体的效价，但增加了其基因组的复制。还有研究通过非基因组修饰的方法，对 T7 噬菌体的次要衣壳蛋白进行改造，为噬菌体的工程改造提供了新的思路。
反应条件的优化也不容忽视。反应体积一般在 10 - 20 μL 到 1 mL 之间，要根据容器大小和反应需求进行调整，较小体积的反应可以在 V 型底多孔板中进行，较大体积则需要适当摇晃以保证氧气供应。反应温度通常在 29°C - 37°C 之间，较低温度使用较多，反应时间因实验目的和噬菌体种类而异，从 3 - 20 小时不等。
不过，无细胞表达系统也存在一些局限性。随着时间推移，系统中必要的成分和能量会逐渐耗尽，同时会产生和积累抑制性副产物，影响蛋白质合成效率，不过可以通过连续流和连续交换的 CFPS 反应器来解决这一问题。此外，商业化的无细胞表达系统成本较高，对于大规模蛋白质生产来说是个不小的负担，但可以通过自制细胞提取物、优化反应混合物成分等方式来降低成本。在蛋白质折叠和翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）方面，基于大肠杆菌的系统存在一定挑战，虽然可以通过补充糖基化机制来实现，但还需要进一步研究和优化。
总的来说，这项研究表明无细胞表达系统是一个极具潜力的噬菌体生产和工程改造平台。它能快速生成噬菌体，无需依赖活细菌培养，为合成生物学研究提供了便利。研究人员可以轻松地在体外对噬菌体基因组进行修改和表达，加速新型噬菌体的开发，用于生物技术、医学和诊断等多个领域。但目前该系统还存在一些需要改进的地方，未来的研究可以朝着优化系统成分、开发新的宿主菌株、改进反应条件等方向进行，进一步挖掘无细胞表达系统的潜力，让它在对抗耐药菌感染的战斗中发挥更大的作用，为人类健康带来更多的希望。
