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为解决三阴性乳腺癌（TNBC）治疗难题，意大利马里奥?内格里药理研究所等单位的研究人员开展 ERO1A 抑制研究。结果发现小分子抑制 ERO1A 可抑制 TNBC 发展。这为 TNBC 治疗提供新方向，值得科研人员一读。
在肿瘤的世界里，癌细胞就像一群狡猾又顽强的 “侵略者”，它们能在恶劣的环境中不断适应、发展壮大。肿瘤内部常常处于缺氧、营养匮乏的状态，还伴随着各种致癌突变，这就像是给癌细胞设置了重重 “障碍关卡”。但癌细胞却有自己的 “生存秘籍”—— 激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），以此来维持内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）的稳定，让自己更好地存活和扩散。
在这个过程中，内质网氧化还原酶 1A（Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 A，ERO1A）发挥着重要作用。它就像癌细胞的 “得力助手”，作为一种蛋白质二硫键氧化酶，帮助癌细胞折叠蛋白质。尤其是在缺氧条件下，ERO1A 能助力血管内皮生长因子 A（Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA）的折叠，促进肿瘤血管生成，让癌细胞有更多的 “补给通道”，从而在体内肆意生长和转移。而且，ERO1A 在很多癌症中都呈现高表达状态，这往往意味着患者的临床预后更差。
三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）堪称乳腺癌中的 “头号反派”，是最具侵袭性的一种类型。它占乳腺癌病例的 12 - 17%，由于缺乏有效的治疗方法，患者的预后十分糟糕。TNBC 患者的肿瘤细胞中，ERO1A 表达水平很高，它帮助癌细胞在恶劣环境中存活，促进肿瘤血管生成和转移。因此，抑制 ERO1A 有望成为治疗 TNBC 的新策略。
来自意大利马里奥?内格里药理研究所（Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS）等多个单位的研究人员，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Small molecule-mediated inhibition of the oxidoreductase ERO1A restrains aggressive breast cancer by impairing VEGF and PD-L1 in the tumor microenvironment” 的论文。他们发现，通过小分子抑制 ERO1A，可以有效抑制 TNBC 的发展，这为 TNBC 的治疗带来了新的希望。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- 分子对接研究：借助计算机模拟技术，研究人员模拟了抑制剂与 ERO1A 的结合情况，分析它们之间的相互作用，探索抑制剂发挥作用的机制。
- 细胞实验技术：使用多种细胞系，如 MDA - MB - 231、E0771 等，通过一系列实验检测细胞的代谢活性、迁移能力、VEGF 分泌水平等指标，评估 ERO1A 抑制剂对癌细胞的影响。
- 动物实验模型：构建 TNBC 小鼠模型，包括将人 MDA - MB - 231 细胞接种到 SCID 小鼠体内，以及将小鼠 E0771 细胞接种到同基因 C57BL/6J 小鼠体内，观察抑制剂在体内对肿瘤生长、VEGF 水平和肿瘤微环境的影响。
下面，让我们详细看看研究人员都取得了哪些重要的研究结果：
ERO1A 表达在 TNBC 中上调且与肿瘤增殖相关
研究人员发现，ERO1A 在不同癌症类型中都有上调现象，但它的 “兄弟” ERO1B 在肿瘤组织中却没有这种变化，这说明在癌症发展过程中，ERO1A 比 ERO1B 更重要。通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，他们发现 ERO1A 在更具侵袭性的基底型乳腺癌亚型（包括 TNBC）中表达更高。为了进一步验证，研究人员利用组织微阵列（Tissue Microarray，TMA），对 100 个人类乳腺癌样本进行了 ERO1A 免疫荧光检测。结果显示，ERO1A 在 TNBC 中的表达水平明显高于其他类型的乳腺癌，并且与增殖指标 Ki67 呈正相关。这意味着 ERO1A 不仅在 TNBC 中大量存在，还可能在促进肿瘤细胞增殖方面发挥着重要作用。此外，TNBC 患者中 ERO1A 高表达还与肿瘤复发和转移风险增加有关，这表明 ERO1A 有望成为预测乳腺癌预后的生物标志物和癌症治疗的潜在靶点。
新型 ERO1A 抑制剂的化学研究
为了找到更有效的 ERO1A 抑制剂，研究人员对先导化合物 EN460 进行了改造，合成了一系列类似物（I1 - I16） 。他们对 EN460 的四个化学基团进行修饰，分别研究不同取代基对其三维构象、α,β 不饱和双键反应性、吡唑啉酮反应性以及与 ERO1A 非键相互作用特异性的影响。同时，通过基于配体的虚拟筛选，从 Enamine 公司筛选出了可能具有类似活性的商业类似物（I17 - I23） 。这些化合物就像研究人员精心打造的 “武器库”，等待着被测试和筛选。
基于细胞的筛选以鉴定有效的 ERO1A 抑制剂
VEGFA 的分泌与 ERO1A 的活性密切相关，因此研究人员以 VEGFA 分泌作为衡量 ERO1A 抑制效果的重要指标。他们将 23 种化合物和 EN460 加入到过表达 VEGFA - FLAG 的 HeLa 细胞培养基中，经过处理后，收集条件培养基进行免疫印迹分析和表面等离子共振检测。结果发现，在这 23 种化合物中，只有 I2 和 I3 能够像 EN460 一样有效抑制 VEGFA 的分泌，并且 I2 的表现更为出色。接着，研究人员通过非还原免疫印迹法检测细胞中 ERO1A 的氧化还原状态。他们发现，EN460、I2 和 I3 能够使 ERO1A 处于还原状态，而其他化合物则没有这种作用。在剂量反应实验中，I2、I3 和 EN460 在 20 μM 时能显著降低 ERO1A 的氧化态，但 I3 和 EN460 在 50 μM 时表现出细胞毒性，相比之下，I2 在抑制 VEGFA 分泌和细胞迁移方面比 EN460 更有效。这些结果表明，I2 和 I3 是非常有潜力的 ERO1A 抑制剂。
ERO1A 抑制剂的分子对接
研究人员采用共价配体对接技术，模拟了 EN460 与 ERO1A 形成的复合物结构。结果显示，EN460 位于 ERO1A 中原本由 FAD 的异咯嗪部分占据的口袋区域，催化残基 Cys397 会对 EN460 的特定碳原子发起亲核攻击。这一过程解释了为什么缺少迈克尔受体的 I15 没有抑制活性，以及 I14 由于取代基电子性质不同而表现出惰性的原因。此外，EN460 还与 ERO1A 中的一些氨基酸形成 π - 堆积相互作用和其他非键相互作用。通过对不同化合物的分析，研究人员发现，能够与 ERO1A 形成特定非键相互作用、并在结合位点采取非共面重排的化合物才具有抑制活性，这进一步揭示了 ERO1A 抑制剂发挥作用的结构基础。
抑制剂介导的 ERO1A 氧化还原状态变化
为了明确活性抑制剂是否直接与 ERO1A 结合并改变其氧化还原状态，研究人员纯化了重组小鼠 ERO1A 蛋白，并将其与 EN460 和 23 种化合物进行反应。实验结果表明，EN460、I2、I3 等多种化合物能够使重组 ERO1A 蛋白处于还原状态，而其他一些化合物则没有这种效果。在剂量反应实验中，I2 对 ERO1A 的还原效果略优于 EN460 和 I3，而没有活性的 I15 则无法改变 ERO1A 的氧化还原状态。此外，通过动力学实验测定，EN460、I2 和 I3 对 ERO1A 的抑制常数 IC??都在低微摩尔级别，这表明它们能够有效地抑制 ERO1A 的活性。这些实验结果在体外证实了活性 ERO1A 抑制剂能够直接与 ERO1A 结合，促进其氧化还原状态的改变，使其处于无活性的还原状态。
ERO1A 抑制剂在 TNBC 细胞中的细胞毒性和抗血管生成特性
研究人员发现，EN460、I2 和 I3 能够剂量依赖性地抑制 MDA - MB - 231 细胞的代谢活性，而 I1 和 I6 则没有这种作用。通过 MALDI 成像技术，研究人员检测到 EN460 和 I2 能够被细胞摄取到微摩尔浓度范围。进一步分析发现，EN460、I2 和 I3 能够将 MDA - MB - 231 细胞中的 ERO1A 捕获在还原状态，这表明细胞代谢活性的受损与 ERO1A 的抑制之间存在直接关系。与 I2 相比，EN460 在相同剂量下诱导更多的细胞凋亡，但 I2 在抑制细胞迁移和 VEGF 分泌方面更为有效。在另一种小鼠乳腺癌细胞系 E0771 中，研究人员也得到了类似的结果，即 EN460 和 I2 都能抑制细胞代谢活性，且 ERO1A 基因敲除的细胞对这两种抑制剂更具抗性，同时 I2 在抑制细胞迁移和 VEGF 分泌方面表现更优。这些结果表明，I2 通过抑制 VEGF 和相关细胞迁移发挥其抗癌功效。
ERO1A 抑制在 TNBC 荷瘤小鼠中的疗效
研究人员在 TNBC 荷瘤小鼠模型中评估了 EN460 和 I2 的体内活性。在人 MDA - MB - 231 细胞接种的 SCID 小鼠模型和小鼠 E0771 细胞接种的同基因 C57BL/6J 小鼠模型中，小鼠对高达 10 mg/kg 剂量的 EN460 和 I2 耐受性良好，没有明显的毒性迹象。通过 MALDI 成像分析发现，这两种化合物能够有效地到达肿瘤组织。在 MDA - MB - 231 荷瘤小鼠中，虽然 EN460 和 I2 治疗组的肿瘤生长速度略有下降，但差异不具有统计学意义。不过，ELISA 检测结果显示，这两组小鼠肿瘤中的 VEGFA 水平明显降低。对肿瘤组织进行 RNA 测序分析发现，接受 EN460 和 I2 治疗的肿瘤中，参与细胞增殖的基因集表达下调。在 E0771 荷瘤小鼠模型中，EN460 和 I2 同样抑制了肿瘤的生长，并且降低了肿瘤中的 VEGFA 水平。此外，在原位接种 E0771 细胞的小鼠模型中，I2 治疗组的肿瘤中 PD - L1 在单核细胞来源的髓源性抑制细胞（M - MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中的表达降低。这些结果表明，ERO1A 抑制能够减少肿瘤质量，抑制细胞增殖途径，降低 VEGFA 水平，并调节免疫检查点 PD - L1，从而限制肿瘤的生长和发展。
在讨论部分，研究人员指出，ERO1A 虽然在健康细胞中并非不可或缺，但在肿瘤细胞中却起着关键作用，尤其是在 TNBC 中。它的高表达与肿瘤的侵袭性、血管生成以及不良预后密切相关。之前的研究已经表明，基因敲除 ERO1A 可以抑制 TNBC 小鼠模型中的肿瘤生长和血管生成，增强抗血管生成治疗的效果。而在这项研究中，研究人员通过对 EN460 进行结构优化，筛选出了 I2 和 I3 等有效的 ERO1A 抑制剂。这些抑制剂不仅在体外实验中表现出良好的抑制活性，在体内实验中也能够有效地抑制肿瘤生长，且没有明显的毒性。这为 TNBC 的治疗提供了一种创新且可行的方法，有望开发出新型的抗癌药物。
总的来说，这项研究意义重大。它揭示了 ERO1A 在 TNBC 中的重要作用，为 TNBC 的治疗找到了一个极具潜力的新靶点。通过小分子抑制 ERO1A 的策略，为开发新型抗癌药物开辟了新的方向。未来，有望基于这些研究成果，进一步优化抑制剂的结构，提高其疗效，为 TNBC 患者带来新的希望，让我们在对抗癌症的道路上迈出更加坚实的一步。
