《Cell Death Discovery》：Decreased miR-128-3p in serum exosomes from polycystic ovary syndrome induces ferroptosis in granulosa cells via the p38/JNK/SLC7A11 axis through targeting CSF1
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为探究 PCOS 发病机制，延边大学研究人员开展血清外泌体 miR-128-3p 与颗粒细胞铁死亡关系的研究。结果发现其调控机制及 miR-128-3p 的治疗潜力。该研究为 PCOS 诊疗提供新方向，值得科研读者一读。
在生殖健康的领域里，多囊卵巢综合征（PCOS）就像一个神秘的谜题，困扰着众多女性和科研人员。PCOS 是一种常见的内分泌和代谢紊乱疾病，影响着 6 - 20% 处于生育年龄的女性。它的临床表现多种多样，多毛、闭经、高胰岛素血症、肥胖、高雄激素血症，还有通过超声检查能发现的多囊卵巢，这些症状给患者的生活和生育带来了极大的困扰。
卵巢中的颗粒细胞（GCs）在卵泡的微环境中起着关键作用，就像土壤对于植物生长一样重要。然而，PCOS 患者的卵巢功能常常出现异常，这与颗粒细胞的代谢紊乱和细胞死亡调节异常密切相关。近年来，研究发现铁死亡（一种由细胞内氧化还原系统失衡导致细胞膜脂质过氧化，最终引发细胞死亡的程序性细胞死亡形式）在 PCOS 的发病过程中有着重要作用。但目前关于颗粒细胞死亡的具体机制，尤其是铁死亡在 PCOS 中的详细作用机制，还像被迷雾笼罩一样，让科研人员摸不着头脑。
外泌体（EXOs）作为细胞间通信的 “小邮差”，在身体的各种体液中穿梭，携带蛋白质、脂质、mRNA 和 miRNA 等生物活性物质，对细胞间的交流起着至关重要的作用。其中，外泌体中的 miRNA 由于受到保护，不易被 RNase 降解，成为了潜在的临床生物标志物和预后靶点。近年来，外泌体及其携带的 miRNA 在 PCOS 中的作用逐渐受到关注，但相关研究还处于起步阶段。
为了揭开 PCOS 发病机制的神秘面纱，来自延边大学的研究人员在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “Decreased miR - 128 - 3p in serum exosomes from polycystic ovary syndrome induces ferroptosis in granulosa cells via the p38/JNK/SLC7A11 axis through targeting CSF1” 的论文。他们的研究发现为 PCOS 的治疗带来了新的曙光，就像在黑暗中点亮了一盏明灯。研究表明，PCOS 小鼠血清来源的外泌体能够促进颗粒细胞发生铁死亡，导致体内出现类似 PCOS 的表型。其中，miR - 128 - 3p 起着关键的调节作用，它可以通过靶向 CSF1，调控脂质过氧化和颗粒细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。并且，向小鼠卵巢中注射 miR - 128 - 3p AgomiR 能够改善类似 PCOS 的特征，恢复小鼠的生育能力。这一发现为 PCOS 的治疗提供了极具潜力的治疗靶点，有望为众多患者带来新的希望。
研究人员为了开展这项研究，使用了多个关键技术方法。首先，他们构建了 PCOS 小鼠模型，将 21 日龄的 C57BL/6N 雌性小鼠分为 PCOS 组和对照组，通过给 PCOS 组小鼠注射来曲唑（letrozole）溶液，成功模拟出 PCOS 的症状。接着，他们利用差速离心法从血清中分离出了外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术对外泌体进行了鉴定。在细胞实验方面，他们培养了小鼠原代颗粒细胞（mGCs）和人卵巢颗粒细胞（KGN），并进行了转染实验。同时，运用生物信息学分析筛选出差异表达的 miRNA，通过双荧光素酶报告基因实验验证 miRNA 与靶基因的靶向关系。此外，还使用了实时荧光定量 PCR（RT - qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术检测基因和蛋白的表达水平。
下面让我们详细看看研究结果。
PCOS 血清来源的 EXOs 促进 GC 铁死亡
研究人员推测，PCOS 患者循环血清中可能含有诱导卵巢颗粒细胞功能障碍的致病信号。他们发现，与对照组相比，PCOS 小鼠血清处理后的颗粒细胞活力明显下降，就像失去了活力的小树苗。同时，铁死亡相关基因 SLC7A11 和 GPX4 的表达受到抑制，线粒体膜电位（MMP）也降低了，这表明 PCOS 小鼠血清中可能存在促进颗粒细胞铁死亡的功能因子。为了进一步验证外泌体是否介导了这种作用，研究人员分离了小鼠血清外泌体。通过观察，发现这些外泌体具有典型的形态特征，且标记的外泌体能被颗粒细胞摄取。用 PCOS 血清来源的外泌体处理颗粒细胞后，出现了与 PCOS 小鼠血清处理类似的表型，这就证明了 PCOS 血清来源的外泌体确实能促进颗粒细胞铁死亡。
PCOS 小鼠血清来源的 EXOs 诱导青春期小鼠发情紊乱并增加铁死亡
在体内实验中，研究人员给小鼠注射了血清来源的外泌体。结果发现，注射后小鼠卵巢组织中能观察到可见的 DiL 荧光，这说明外泌体成功进入了卵巢组织。虽然注射外泌体后小鼠的体重和卵巢重量在两周内没有明显变化，但血清中的 E2 和 T 水平却显著增加，导致小鼠发情周期失调。组织学分析显示，注射 PCOS 小鼠血清来源外泌体的小鼠卵巢中黄体数量明显减少，同时 SLC7A11 和 GPX4 的表达也受到抑制。这些结果表明，PCOS 小鼠血清来源的外泌体在体内也能介导卵巢颗粒细胞的铁死亡。
PCOS 小鼠血清来源的 EXOs 中 miR - 128 - 3p 表达较低
研究人员对 PCOS 小鼠血清来源外泌体中的 miRNA 进行了高通量测序分析，发现了 35 种差异表达的 miRNA。通过与公开的 RNA - seq 数据集进行关联分析，他们发现 miR - 128 - 3p 在 PCOS 患者和类似 PCOS 的小鼠中均显著下调。这一发现引起了研究人员的极大兴趣，他们决定进一步探究 miR - 128 - 3p 在 PCOS 中的作用。
miR - 128 - 3p 抑制 GC 铁死亡
研究人员选择 miR - 128 - 3p 作为研究对象，发现它在调节颗粒细胞铁死亡方面有着重要作用。用 miR - 128 - 3p 模拟物转染小鼠卵巢颗粒细胞后，细胞活力明显增加，就像给细胞打了一针 “强心剂”。同时，miR - 128 - 3p 过表达能显著抑制由 erastin（Era）诱导的活性氧（ROS）产生和谷胱甘肽（GSH）消耗，减少丙二醛（MDA）、脂质过氧化和 Fe2?的产生，改善线粒体膜电位（MMP），缓解线粒体形态的改变。此外，miR - 128 - 3p 还能调节氧化应激和铁死亡相关基因的表达，下调促进铁死亡的基因 ACSL4、PTGS2 和 SAT1 的表达，上调抑制铁死亡的基因 SOD、CAT、NRF2、SLC7A11 和 GPX4 的表达。相反，用 miR - 128 - 3p 抑制剂处理颗粒细胞后，细胞活力下降，ROS、Fe2?和 MDA 水平升高，GSH 和 MMP 水平降低，脂质过氧化增加，线粒体形态受损。而铁死亡抑制剂 Fer - 1 能有效减轻 miR - 128 - 3p 抑制剂的这些作用，这充分验证了 miR - 128 - 3p 是颗粒细胞铁死亡的关键调节因子。
CSF1 是 miR - 128 - 3p 的靶基因
通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验，研究人员证实了 CSF1 是 miR - 128 - 3p 的直接靶基因。在人和小鼠中，CSF1 的 3′UTR 与 miR - 128 - 3p 种子序列的结合位点高度保守。转染 miR - 128 - 3p 模拟物会导致 CSF1 的 mRNA 和蛋白水平下降，而转染 miR - 128 - 3p 抑制剂则会使 CSF1 的表达增加。此外，在 PCOS 小鼠的卵巢中，CSF1 的表达明显升高。这些结果表明，卵巢中 CSF1 的高表达可能是 PCOS 中卵巢颗粒细胞铁死亡的关键因素。
CSF1 介导 miR - 128 - 3p 对 GCs 的作用
为了验证 CSF1 在颗粒细胞铁死亡中的作用，研究人员用 siRNA - CSF1 转染颗粒细胞。结果发现，抑制 CSF1 的表达能显著提高细胞活力，减少 ROS、Fe2?、MDA 和脂质过氧化水平，增加 GSH 和 MMP 水平，改善线粒体形态，调节氧化应激和铁死亡相关基因的表达。同时，过表达 CSF1 会削弱 miR - 128 - 3p 对脂质过氧化和铁死亡的抑制作用。这就说明，CSF1 是 miR - 128 - 3p 的功能靶点，介导了 miR - 128 - 3p 对颗粒细胞氧化应激和铁死亡的调节作用。此外，研究人员还构建了 lncRNA - miRNA - mRNA 调控网络，发现可能存在靶向 miR - 128 - 3p/CSF1 调控轴的功能性 lncRNA。
抑制 miR - 128 - 3p 通过激活 P38/JNK 通路抑制 SLC7A11 转录
MAPK 信号通路在铁死亡诱导中起着关键作用。研究人员发现，PCOS 模型小鼠卵巢和用 miR - 128 - 3p 抑制剂处理的颗粒细胞中，p38、JNK 和 ERK 的磷酸化水平显著增加。抑制 miR - 128 - 3p 会导致 p38、JNK 和 ERK 的磷酸化水平上调，而过表达 miR - 128 - 3p 则会抑制它们的磷酸化。用 p38 抑制剂（SB203580）和 JNK 抑制剂（SP600125）处理颗粒细胞后，能抵消 miR - 128 - 3p 抑制剂对 SLC7A11 和 GPX4 表达的抑制作用，恢复 NRF2 的表达。ChIP - qPCR 分析还表明，miR - 128 - 3p 抑制剂会显著抑制 NRF2 与 SLC7A11 启动子的结合。这一系列结果表明，PCOS 小鼠血清外泌体中 miR - 128 - 3p 表达下调，通过激活 P38/JNK 通路抑制 NRF2 介导的 SLC7A11 转录，从而诱导颗粒细胞铁死亡。
过表达 miR - 128 - 3p 可恢复来曲唑诱导的小鼠 PCOS 样特征
研究人员通过向 PCOS 小鼠卵巢中注射 miR - 128 - 3p AgomiR，发现 miR - 128 - 3p AgomiR 能在卵巢中高效表达，且不会显著影响小鼠体重，但能降低卵巢重量，恢复紊乱的发情周期，抑制 PCOS 模型小鼠血清中 T 水平的升高和 E2 水平的降低，改善来曲唑诱导的囊性卵泡形成，提高小鼠的繁殖能力，使小鼠的后代数量增加。同时，miR - 128 - 3p AgomiR 还能调节氧化应激和铁死亡相关基因的表达，使其恢复到正常水平。这充分说明，miR - 128 - 3p AgomiR 能有效减轻来曲唑诱导的小鼠 PCOS 样特征。
综合来看，这项研究揭示了 PCOS 发病机制中一个重要的分子机制。PCOS 小鼠血清和血清中的外泌体参与了卵巢颗粒细胞的存活调节，其中 miR - 128 - 3p 的表达显著下调。miR - 128 - 3p 的缺乏会导致其靶基因 CSF1 表达增加，进而激活 p38/JNK 信号通路，抑制 NRF2 介导的 SLC7A11 转录，最终导致 ROS 积累和脂质过氧化诱导的铁死亡。而 miR - 128 - 3p AgomiR 的注射则能改善卵巢卵泡发育和小鼠的繁殖能力。这些新发现极大地提高了我们对 PCOS 发病机制的理解，为 PCOS 的诊断和治疗开辟了新的道路。未来，或许可以基于这些发现开发出更加精准有效的治疗方法，帮助众多 PCOS 患者摆脱疾病的困扰，迎来新的生活。
