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为解决单分子活细胞内源性 RNA 成像难题，研究人员开展 smLiveFISH 技术相关研究。结果显示该技术能实时追踪未修饰的内源性 mRNA 动态。推荐阅读，助您了解 RNA 研究新突破，把握前沿科研方向。
在微观的细胞世界里，RNA（核糖核酸）就像一个个忙碌的小信使，它们不仅直接参与蛋白质的合成，还在基因表达的调控中发挥着关键作用。你可别小瞧这些 RNA，它们的一举一动都影响着细胞的正常运作。而且，RNA 的空间和时间分布对其功能的实现至关重要。就好比在细胞这个大工厂里，RNA 需要在特定的时间、特定的地点完成任务，才能保证整个生产流程顺利进行。比如，zipcode - binding protein 1 会帮助 β - actin（ACTB）mRNA 运输到成纤维细胞的前沿，在那里它会被固定在肌动蛋白丝上并进行局部翻译，最终为细胞的生长和运动提供支持。
然而，想要深入了解 RNA 在细胞内的动态行为，科学家们面临着不小的挑战。虽然现有的活细胞 RNA 成像方法已经让我们对 RNA 的动态有了一些了解，但这些方法都存在各自的问题。有些方法需要对 RNA 进行基因插入或依赖外源表达标记 RNA，这不仅耗时，还可能会干扰 RNA 原本的正常行为，就好像给小信使们戴上了枷锁，让它们无法正常工作。而其他用于可视化未修饰内源性 RNA 的方法，又存在单分子分辨率有限的问题，常常只能检测到高度丰富、重复的 RNA，而且背景信号还很强，就像在嘈杂的环境中听人说话，很难听清楚。所以，开发一种通用的单分子活细胞内源性 RNA 成像平台迫在眉睫。
为了解决这些难题，研究人员在《Nature Biotechnology》期刊上发表了题为 “Single - molecule live - cell fluorescence in situ hybridization for visualizing native RNAs” 的论文。他们成功开发出了单分子活细胞荧光原位杂交技术（smLiveFISH），这一技术就像给细胞内的 RNA 装上了 “追踪器”，可以实时、高分辨率地追踪未修饰的内源性 mRNA，揭示它们在活细胞中的时空动态。这一成果为研究 RNA 的行为提供了强有力的工具，意义非凡。
研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法。首先是 CRISPR - Cas 技术，这一技术就像是一把 “基因剪刀”，能够对核酸进行精准的靶向操作。研究人员利用 RNA 靶向的 III - A 型 CRISPR - Csm 复合物和多重引导 RNA 来实现对目标 RNA 的定位。其次是显微镜成像技术，通过宽场荧光显微镜对细胞样本进行成像，并利用 FIJI 等软件对图像进行处理和分析，从而观察 RNA 的动态变化。
下面让我们一起来看看研究人员通过这些技术获得了哪些有趣的结果吧。
设计并表征 smLiveFISH 技术
CRISPR - Cas 复合物原本是原核生物用来抵御噬菌体的 “防御武器”，科学家们巧妙地将其改造，用于标记细胞内的 RNA。研究人员发现，之前使用的一些 CRISPR - Cas 系统标记 RNA 时，由于每个 RNA 仅由单个 crRNA 靶向，导致游离和靶向结合的核糖核蛋白（RNP）荧光强度相似，难以达到单分子分辨率。于是，他们从单分子荧光原位杂交（smFISH）技术中获得灵感。在 smFISH 技术中，短的荧光标记 DNA 探针沿着目标 RNA 排列，就像给 RNA 穿上了一件荧光 “外套”，大大提高了信噪比。研究人员推测，如果能让荧光标记的 RNPs 同时沿着目标 RNA 排列，或许就能实现活细胞内源性 RNA 的单分子成像。
他们比较了 GFP 融合的 Cas13 和 Csm 复合物的标记性能，发现只有 Csm 复合物能够有效地标记 XIST RNA。而且，Csm 复合物还有其他优点，它含有多个与 GFP 相连的催化失活的 Csm3 分子，这增强了信号，有助于单分子检测；同时，它对 RNA 的结合亲和力更高。基于这些优势，研究人员选择 Csm 复合物来开发单分子 mRNA 标记系统。
为了让这个系统能够在细胞质中发挥作用，研究人员对其进行了一系列改造。他们去除了哺乳动物优化的 Csm 系统中每个蛋白质组分的核定位信号（NLS），并在 CRISPR 阵列的 5′端添加了一个短信号序列，帮助 pre - crRNA 从细胞核转运到细胞质。之后，他们以 NOTCH2 mRNA 为目标进行验证，设计了多个靶向 NOTCH2 mRNA 3′非翻译区（UTR）的 crRNAs，并将它们整合到 CRISPR 阵列中。实验结果显示，Csm 复合物能够成功标记内源性 NOTCH2 mRNA，且标记效率高，同时对 mRNA 的活性没有明显影响，这表明 smLiveFISH 是一种可靠、高效且微创的工具。
smLiveFISH 实现对单个 NOTCH2 mRNAs 的可视化
研究人员利用 NOTCH2 smFISH 技术，对转染了 crRNA 阵列编码质粒和 Csm 复合物质粒的细胞进行观察。通过双色成像，他们发现 Csm 标记的焦点与 smFISH 斑点有很强的共定位，这意味着 GFP 标记的 Csm 复合物成功标记了内源性 NOTCH2 mRNA。进一步量化分析表明，85% 的 Csm 标记斑点与 smFISH 斑点共定位，而且 78% 的转染细胞在细胞质中能观察到明显可区分的斑点，说明标记效率很高。研究人员还测试了不同数量的 crRNAs 对 NOTCH2 mRNA 标记的影响，发现虽然用少至 6 个 crRNAs 也能检测到单个 mRNA 分子，但信号与背景的区分度不如使用更多 crRNAs 时明显。
此外，研究人员在多种细胞系中进行了实验，包括 HEK293T、HeLa、原代人成纤维细胞 IMR - 90 和非洲绿猴 COS - 7 细胞等，结果表明 smLiveFISH 在这些细胞中都能有效地标记内源性 NOTCH2 mRNA，证明了该技术的广泛适用性。
NOTCH2 mRNAs 显示出翻译依赖的动力学
研究人员通过活细胞成像观察 U2OS 细胞中 NOTCH2 mRNA 的动态，发现根据其扩散动力学，NOTCH2 mRNA 可分为两个不同的群体：慢移动和快移动群体。他们推测，NOTCH2 mRNA 的慢移动群体可能是因为与内质网（ER）膜结合，以便新生多肽进行共翻译转运。为了验证这一推测，他们用嘌呤霉素（一种翻译延伸抑制剂）处理细胞。结果发现，经嘌呤霉素处理后，静态的 NOTCH2 mRNA 群体迅速减少，而且 NOTCH2 mRNA 群体从慢移动向快移动转变。这表明 NOTCH2 转录本与核周区域的固定结合是翻译依赖的，与 mRNA 停靠以促进肽穿过内质网的转运这一过程相符。
MAP1B mRNAs 通过定向运输定位于细胞边缘
为了探究 smLiveFISH 技术的通用性，研究人员选择了另一种 mRNA——MAP1B mRNA 进行研究。MAP1B mRNA 编码一种参与神经元发育过程中轴突生长的微管相关蛋白。研究人员设计了 48 个靶向 MAP1B mRNA 3′UTR 的 crRNAs，并转染到 U2OS 细胞中。结果在细胞质中观察到了代表 MAP1B mRNA 信号的单分子斑点，而且这些斑点与单独的 MAP1B smFISH 探针标记的斑点有很强的共定位。
通过测量 mRNA 分子到细胞核和细胞边缘的距离，研究人员发现 MAP1B mRNAs 在细胞周边富集，而 NOTCH2 mRNAs 在核周区域富集。进一步的活细胞成像显示，与 NOTCH2 mRNA 不同，MAP1B mRNAs 经常呈现向细胞边缘的线性运输，到达细胞边缘后相对静止，偶尔会向细胞核方向移动，但最终还是会向细胞边缘移动。结合之前的研究，RNA 免疫沉淀实验表明微管运动蛋白驱动蛋白 - 1 与 MAP1B mRNAs 存在相互作用，这说明 MAP1B mRNA 利用微管上的定向运输作为动力定位于细胞边缘。
翻译抑制使 MAP1B mRNA 在 P - 体中聚集
大多数运输中的 mRNA 被认为在到达目的地进行局部翻译之前是翻译不活跃的，但也有研究表明翻译可以在运输之前或过程中发生。研究人员想知道抑制翻译是否会影响 MAP1B mRNA 的运输和定位动态，于是他们用嘌呤霉素处理细胞并进行 smLiveFISH 实验。结果发现，嘌呤霉素处理并没有改变 MAP1B mRNA 向细胞边缘的定向运输，反而使其平均运输速度略有增加。这表明 MAP1B mRNA 的运动与翻译并不耦合。
有趣的是，嘌呤霉素处理后，一些 MAP1B mRNAs 会聚集成更大的颗粒。由于嘌呤霉素处理可诱导 U2OS 细胞中 P - 体的形成和增大，研究人员通过与 P - 体标记物 DCP1A 共染色发现，嘌呤霉素处理后 P - 体数量增加，且 MAP1B mRNA 颗粒与 P - 体共定位。这说明 smLiveFISH 可用于研究活细胞中的 RNA 储存和代谢。
总的来说，研究人员开发的 smLiveFISH 技术为实时追踪未修饰的内源性 mRNAs 提供了有力工具。通过这项技术，研究人员揭示了 NOTCH2 和 MAP1B mRNA 分别通过共翻译转运和定向运输定位于细胞的不同区域，还发现了它们在翻译抑制后的不同行为。这一技术不仅克服了以往活细胞 RNA 成像技术的诸多缺点，能够对低丰度和非重复 RNA 进行成像，而且为研究 RNA 的时空动态提供了新的视角。在未来，smLiveFISH 技术有望在 RNA、细胞生物学和神经生物学等领域发挥重要作用，帮助科学家们更深入地了解 RNA 在健康和疾病状态下的行为，探索相关疾病的病理机制，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
