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为解决 DCX 在神经元迁移中作用机制不明等问题，麦吉尔大学研究人员开展 DCX 相关研究，发现 DCX 通过调节 α -tubulin 多聚谷氨酸化限制神经突分支。该成果有助于理解相关脑部疾病，推荐科研读者阅读。
在人类大脑发育的奇妙旅程中，神经元的迁移和正确定位至关重要。大约有 10?1?个新生神经元要从它们的干细胞龛迁移出去，构建起大脑皮层这座 “高楼大厦”。在这个过程里，神经元的微管细胞骨架起着关键作用，它就像建筑工人手中的脚手架，为神经元的迁移提供支撑和动力。
而 Doublecortin（DCX），作为一种神经元微管相关蛋白，无疑是这个建筑工程中的重要 “角色”。DCX 基因位于 X 染色体上，它的突变可不得了，会导致神经元迁移失败，进而引发诸如双皮质综合征和 X 连锁无脑回畸形等疾病，让大脑皮层的分层变得杂乱无章。
不过，尽管科学家们知道 DCX 很重要，但对于它在微管调节中的具体结构作用，却存在诸多相互矛盾的假说。之前的研究中，DCX（半合子）小鼠表型很轻微，而用 shRNA 介导敲低 DCX 的大鼠胚胎却出现了严重的皮质迁移缺陷，可这种 RNAi 方法又存在脱靶效应，使得研究结果的解读变得困难重重。而且，在非 shRNA 介导的神经元模型中，关于微管动力学和细胞内运输等基本细胞数据都还未被测量。这一系列的问题就像一团团迷雾，笼罩在 DCX 的研究领域，让科学家们迫切地想要找到答案。
为了拨开这团迷雾，来自麦吉尔大学的研究人员勇挑重担。他们在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Doublecortin restricts neuronal branching by regulating tubulin polyglutamylation” 的论文，为我们揭示了 DCX 的神秘面纱。研究发现，DCX 通过调节 α - 微管蛋白多聚谷氨酸化（一种对神经元微管功能至关重要的修饰）来限制神经突分支。这一发现不仅为理解双皮质综合征和 X 连锁无脑回畸形的细胞基础提供了新视角，还让我们对神经元发育过程中的分子机制有了更深入的认识，就像是为我们打开了一扇通往神经元微观世界的新大门。
研究人员为了开展这项研究，运用了多种先进的技术方法。他们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对人类诱导多能干细胞（iPSCs）进行基因编辑，构建出 DCX 基因敲除（DCX - KO）和患者突变的 iPSC 模型，就像是给细胞做了一场精准的 “基因手术”。通过免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹技术，他们能够检测细胞内各种蛋白和修饰的表达水平，就像拿着一个微观世界的 “探测器”。此外，还借助显微镜成像技术，对神经元的形态、运动以及微管动态进行观察和分析，让我们得以直观地看到细胞内部的活动情况。
下面我们来详细看看研究人员都发现了什么。
核迁移在 DCX - KO 皮质神经元中受损
研究人员运用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术，在男性 iPSC 系中敲除 DCX 的表达。经过一系列复杂的操作和验证后，得到了 DCX - KO 的皮质神经元。在观察这些神经元时，他们发现，DCX - KO 神经元的核迁移出现了问题。通过自动追踪算法测量核的位移，结果显示，DCX - KO 神经元的核移动速度明显变慢，平均速度从对照神经元的 0.27 ± 0.01 μm/min 降至 0.17 ± 0.01 μm/min，而且移动的距离更短，方向也更不明确。这就好比原本在高速公路上顺畅行驶的汽车，突然减速、偏离路线，还走得磕磕绊绊。这个结果与之前在 DCX 敲除的外植体神经元中观察到的核迁移缺陷一致，表明 DCX 在神经元核迁移过程中起着重要的调节作用。
DCX - KO 神经元通过增加起始速率建立更多分支
神经元迁移包括核迁移和神经突延伸两个重要步骤。研究人员发现 DCX 在神经突尖端富集，于是他们猜测神经突的缺陷可能也与神经元迁移缺陷有关。通过显微镜观察单个神经突，他们发现 DCX - KO 神经元的神经突分支形成过程出现了异常。虽然神经突的伸长和收缩速率在 DCX - KO 和对照神经元之间没有显著变化，但 DCX - KO 神经元的神经突起始事件数量增加，同时回缩事件数量也有所增加，但幅度较小，最终导致每个细胞的神经突形成数量比对照神经元增加了两倍。这就好像是原本精心规划的道路施工，突然多了很多不必要的岔路，使得神经突的生长变得杂乱无章。这些结果表明 DCX 在限制神经突形成方面起着重要作用，过多的神经突分支可能会阻碍神经元的迁移，与之前关于 X 连锁无脑回畸形和双皮质综合征患者神经元迁移缺陷的假设相吻合。
微管动力学在 DCX - KO 神经元中不受影响
神经突分支增加的原因是什么呢？研究人员想到了微管动力学，因为微管动力学在分支过程中起着重要作用。他们首先对总微管蛋白进行染色，发现 DCX - KO 神经元的总微管蛋白水平相当，只是 Tubb3 的强度略有降低。接着，通过瞬时表达 EB3 - mCherry 来观察微管动力学，结果发现，无论在神经突尖端还是轴突，DCX - KO 和对照神经元的 EB3 彗星动力学（包括彗星密度、速度和寿命等）都没有显著差异。不过，他们也注意到 DCX - KO 神经元中逆行彗星的比例略有增加，并且 EB3 装饰的微管覆盖面积减少，这表明 DCX 可能对生长锥形态有一定贡献。虽然 DCX - KO 似乎增加了微管灾难后的收缩速率，但这并不能充分解释神经突分支起始事件的增加。这就像是原本以为是微管动力学这个 “引擎” 出了问题导致神经突分支异常，结果发现它并不是主要原因，研究人员还得继续寻找真正的 “幕后黑手”。
DCX - KO 神经元显示出改变的 DCLK1 定位和溶酶体运动
DCX 还被认为在调节细胞内运输方面发挥作用，而功能失调的货物运输可能是导致神经突分支过多的原因。研究人员通过免疫细胞化学测量了几种分子马达和微管相关蛋白（MAPs）的强度分布，发现 DCX - KO 神经元中 DCLK1 的信号增加了 1.4 倍，但这并不是因为其表达水平升高，而是可能由于其同源物对 DCX 结合位点的占用增加。同时，其他分子马达如驱动蛋白 - 1、驱动蛋白 - 2、驱动蛋白 - 3 和动力蛋白的强度没有显著改变。为了进一步研究 DCX 在货物运输中的作用，研究人员用 pH 敏感的溶酶体示踪剂（Lysotracker dye）测量溶酶体的轨迹。结果发现，DCX - KO 神经元中溶酶体的运动出现了变化，其均方位移（MSD）、回转半径（Rg）等反映货物一般运动性的指标显著降低，而且溶酶体的运动更不连续，从过程性运动转变为更多的扩散性和静止性运动。这就好比是细胞内的 “运输车队”（溶酶体）在运输货物时，原本高效的运输路线变得拥堵，运输效率大大降低。不过，这种溶酶体运输的缺陷相对较轻，可能不足以解释 DCX - KO 神经元中过多的分支表型。
DCX - KO 破坏微管多聚谷氨酸化
前面的研究结果表明，DCX - KO 神经元存在多种复杂的表型，研究人员推测这些表型可能源于微管生理的上游调节因子 —— 微管蛋白编码（tubulin code，一种微管特化的信息系统，影响微管相关蛋白的结合亲和力、马达蛋白的过程性等）的改变。于是，他们用针对不同微管蛋白翻译后修饰（PTMs）的抗体进行免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹实验。结果令人惊讶，他们发现 DCX - KO 神经元中微管多聚谷氨酸化水平显著降低，而且这种降低在神经元分化的后期阶段（直至 DIV14）仍然存在。同时，其他修饰如乙酰化和去酪氨酸化水平在 DCX - KO 神经元中与对照相比没有变化，而酪氨酸化在细胞体中略有增加。这就像是细胞内的 “修饰工厂” 出现了故障，多聚谷氨酸化这条 “生产线” 的产量大幅下降，而其他 “生产线” 却还在正常运作。这些结果表明 DCX 的表达调节着微管蛋白编码，尤其是神经突中的多聚谷氨酸化水平，而多聚谷氨酸化水平的降低会影响一系列的 MAPs 和马达蛋白，进而影响神经元的功能。
DCX 通过增加微管蛋白多聚谷氨酸化水平降低神经突密度
既然发现 DCX - KO 神经元中多聚谷氨酸化水平降低，研究人员就想知道这种调节是否与神经突分支表型有关。他们将 DCX - GFP 构建体电穿孔导入对照和 DCX - KO 神经元中，测量多聚谷氨酸化水平和神经突密度。结果发现，在重新表达 DCX - GFP 的 DCX - KO 神经元中，多聚谷氨酸化水平增加，神经突密度相应降低至对照神经元水平。然而，令人意外的是，在对照神经元中过表达 DCX - GFP 却降低了多聚谷氨酸化水平，增加了神经突密度，这表明 DCX 蛋白浓度的影响是双相的，适中的浓度才能维持健康的多聚谷氨酸化水平和神经突密度。此外，用紫杉醇（一种能稳定微管、增加 PTMs 水平的化疗药物）处理细胞，也能增加多聚谷氨酸化水平并降低神经突密度。这就像是给细胞吃了一颗 “调节药丸”，改变了多聚谷氨酸化水平，进而影响了神经突的生长情况，进一步证明了 DCX 通过调节多聚谷氨酸化水平来影响神经突分支。
α - 微管蛋白延伸酶 TTLL11 在 DCX - KO 神经元中的表达挽救了神经突密度
多聚谷氨酸化水平是由修饰酶决定的，研究人员猜测表达一种谷氨酸化酶可能会挽救 DCX - KO 模型中的多聚谷氨酸化水平和神经突密度。他们选择了 α - 微管蛋白特异性延伸酶 TTLL11，通过电穿孔将 TTLL11 - mRuby 导入神经元中。结果发现，无论是对照还是 DCX - KO 神经元，表达 TTLL11 - mRuby 后多聚谷氨酸化水平都增加了约 5 倍，而且在 DCX - KO 神经元中，TTLL11 的表达将神经突密度挽救回对照水平。这就像是给 DCX - KO 神经元找到了一位 “救星”，TTLL11 的出现让多聚谷氨酸化水平恢复，神经突密度也回到了正常状态，再次证实了 DCX 通过调节多聚谷氨酸化水平来限制神经突分支。
DCX 和 TTLL11 协同调节多聚谷氨酸化水平
TTLL11 对 DCX - KO 表型的挽救让研究人员好奇 DCX 是否通过直接激活 TTLL11 来调节多聚谷氨酸化。他们用 U2OS 细胞作为简化模型系统进行研究，因为 U2OS 细胞在间期 TTLL 表达低、多聚谷氨酸化水平低，且不表达 DCX。在 U2OS 细胞中分别转染 DCX - GFP、TTLL11 - mRuby 或两者共转染后，通过免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹测量多聚谷氨酸化水平。结果发现，DCX 和 TTLL11 共表达时，多聚谷氨酸化水平比单独表达 DCX 或 TTLL11 时增加得更多，呈现出协同效应。在神经元中也观察到了类似的结果，这表明 DCX 作为神经突密度的调节因子，通过控制微管蛋白多聚谷氨酸化，尤其是激活像 TTLL11 这样的谷氨酸化酶来发挥作用。这就好比 DCX 和 TTLL11 是一对默契的 “搭档”，它们相互配合，共同调节着多聚谷氨酸化水平，维持着神经元的正常功能。
DCX 患者突变神经元的多聚谷氨酸化水平降低
为了测试 DCX 突变而非基因敲除是否会干扰多聚谷氨酸化，研究人员利用 CRISPR/Cas9 技术将 X 连锁无脑回畸形患者中发现的 DCX 点突变引入 iPSC 系中，然后评估这些神经元的多聚谷氨酸化水平。结果发现，所有测试的患者突变均导致多聚谷氨酸化水平降低，与突变位点无关。这进一步证明了 DCX 在调节多聚谷氨酸化水平、影响 MAP 亲和力和微管组织方面的核心作用，就像是 DCX 这个 “指挥官” 一旦出现问题，整个多聚谷氨酸化的 “队伍” 就会陷入混乱。
综合这些研究结果，研究人员得出结论：DCX 通过调节 α - 微管蛋白多聚谷氨酸化来限制神经突分支。这一发现为双皮质综合征和 X 连锁无脑回畸形的发病机制提供了新的见解，让我们对神经元发育过程中的分子调控机制有了更深入的认识。同时，也揭示了 DCX 作为微管蛋白编码的重要调节因子，其作用机制涉及到与 TTLL11 等蛋白的协同作用，影响着微管的结构和功能，以及细胞内的运输过程。
不过，研究也存在一些尚未解决的问题。例如，DCX 调节 TTLLs 的具体机制还不明确，到底是直接结合 TTLL 酶将其带到微管晶格，还是通过改变微管蛋白的结构特征间接影响 TTLL 酶的活性，或者两者都有，这还需要进一步的详细生物物理分析来确定。此外，DCX 与肌动蛋白细胞骨架之间是否存在联系，以及 DCX 和 DCLK1 这两个共享结合位点的蛋白在调节微管蛋白编码和神经元发育中的重叠和独立作用，也都有待未来的研究去探索。
这项研究意义重大，它不仅为我们理解神经元发育和相关疾病的发病机制提供了重要线索，还为未来开发针对这些疾病的治疗方法奠定了基础。就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为后续的研究指明了方向，激励着更多的科研人员深入探索神经元微观世界的奥秘。
