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为解决急性心肌梗死（AMI）机制及治疗靶点问题，北部战区总医院研究人员开展 S100A12 对 AMI 影响的研究，发现其经 ANXA5 - 钙轴加重损伤，且与预后相关。该研究成果意义重大，强烈推荐科研读者一读！
在医学领域，急性心肌梗死（AMI）一直是严重威胁人类健康的重大疾病。尽管经皮冠状动脉介入治疗的进步大大降低了 AMI 患者的死亡率，可心力衰竭的患病率却仍在不断攀升。一旦发生 AMI，心肌细胞会迅速出现缺血损伤，这是导致长期心力衰竭的关键因素。因此，深入了解心肌细胞早期缺血损伤的机制，寻找有效的治疗靶点，成为改善 AMI 患者预后的迫切需求。
S100A12 作为 S100 家族中一种新发现的钙调节蛋白，已被证实与多种炎症、代谢疾病以及心血管事件相关。之前的研究还表明，它可能是 ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）早期诊断和预测的潜在生物标志物。然而，S100A12 是否通过调节中性粒细胞影响 AMI 的发生和预后，这一问题一直悬而未决。
中性粒细胞作为 AMI 发生后最早被招募到缺血心脏的免疫细胞，在维持急性炎症反应中起着关键作用。它们释放的中性粒细胞胞外陷阱（NETs），是由染色质、组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白组成的细胞外网状结构。NETs 的释放过程（NETosis）与 AMI 后的炎症扩散和组织损伤密切相关。但 NETs 在 AMI 中的具体作用机制，尤其是 S100A12 与 NETs 之间的联系，还需要进一步探究。
为了揭开这些谜团，北部战区总医院的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “S100A12 triggers NETosis to aggravate myocardial infarction injury via the Annexin A5 - calcium axis” 的论文。他们发现，S100A12 在 AMI 后中性粒细胞中的表达迅速增加，通过 Annexin A5（ANXA5） - 钙轴促进 NETs 的形成，进而加重心肌梗死损伤。此外，血浆中 S100A12 水平与双链 DNA（dsDNA）浓度相关，且与 AMI 患者 1 年随访期间全因死亡风险增加有关。这一研究揭示了 S100A12 - ANXA5 - 钙内流轴作为 AMI 潜在治疗靶点和生物标志物的重要意义 。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是构建转基因小鼠模型，通过将人 S100A12 基因在小鼠髓系细胞中特异性过表达，来模拟体内 S100A12 高表达的情况；其次利用免疫荧光、免疫组化和蛋白质免疫印迹等技术，检测相关蛋白的表达和定位；还采用定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析基因的表达水平；运用流式细胞术和激光共聚焦显微镜等方法检测细胞内钙离子浓度；最后通过蛋白质组学技术筛选差异表达蛋白，探究 S100A12 调节 NETs 形成的分子机制。
下面我们来详细看看研究的具体结果：
- 心肌损伤在 S100A12 过表达转基因小鼠模型中加重：研究人员构建了髓系特异性表达人 S100A12 的转基因（TG）小鼠模型。通过超声心动图、心脏组织染色等方法发现，与野生型（WT）小鼠相比，TG 小鼠在心肌梗死（MI）后第 28 天，射血分数（EF）、缩短分数（FS）显著降低，左心室前壁变薄，瘢痕面积和纤维化比例增大。这表明 S100A12 的表达会恶化 MI 后的心脏功能和心室重构。
- S100A12 增强 NETs 形成，加重 MI 早期心脏组织凋亡：在 TG 小鼠中，研究人员发现 MI 后 S100A12 在心脏组织边缘区域的表达迅速增加，在第 1 天达到峰值，随后逐渐下降。同时，MI 后第 1 天，TG 小鼠梗死组织边缘的 Ly6G 阳性中性粒细胞数量显著增加，且 S100A12 主要在这些中性粒细胞中表达。进一步研究发现，TG - MI 组小鼠梗死心肌组织中 NETs 相关蛋白（NE、MPO、citH3）的表达明显高于 WT - MI 组。此外，TG 小鼠中 Bax/Bcl?和 Cleaved - caspase3/Caspase3 的比值增加，表明 S100A12 可能通过促进 NETs 形成，加重 MI 后心肌细胞凋亡。
- 阻断 NETs 生成减轻 S100A12 诱导的心肌细胞凋亡和心脏功能障碍：为了验证心肌损伤是否由 S100A12 诱导的 NETs 形成所致，研究人员给小鼠腹腔注射 DNase I（一种经典的 NETs 抑制剂）3 天。结果发现，注射 DNase I 后，TG 和 WT 小鼠心肌组织中 NETs 标记物的表达显著降低，Bax/Bcl?和 Cleaved - caspase3/Caspase3 的比值也降低，且 TG 组更为明显。TUNEL 染色显示，DNase I 治疗显著减少了 MI 后凋亡心肌细胞的比例。超声心动图分析表明，DNase I 治疗的 TG 小鼠在 MI 后第 28 天，EF 和 FS 百分比有所改善。这些结果说明，阻断 NETs 生成可以减轻 S100A12 诱导的心肌细胞凋亡和心脏功能障碍。
- S100A12 促进体外和体内 BMDNs 中 NETs 的形成：研究人员分别从 TG 和 WT 小鼠中提取骨髓来源的中性粒细胞（BMDNs）进行体外实验。SYTOX Green 染色、免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹结果显示，S100A12 表达刺激中性粒细胞产生更多 DNA 网状结构，NETs 相关成分（citH3、NE、MPO）和关键酶（PAD4）的表达更高。在中性粒细胞样分化的 HL - 60（dHL - 60）细胞中过表达 S100A12，细胞出现扁平化、黏附增强、胞内空泡提前出现、质膜通透性增加和染色质释放加快等现象，且 NET 相关蛋白的 mRNA 和蛋白水平升高。相反，抑制 S100A12 表达则降低了这些 NETs 标记物的水平。这些结果表明，S100A12 过表达可加速中性粒细胞中 NETs 的形成。
- 中性粒细胞中 S100A12 过表达通过释放 NETs 加重体外心肌细胞凋亡：研究人员构建了 dHL - 60 中性粒细胞和 HL - 1 心肌细胞的共培养系统。通过 siRNA 转染和 S100A12 质粒过表达分别降低和增加 dHL - 60 中性粒细胞中 S100A12 的含量，并添加 DNase I 抑制 NETs 形成。蛋白质免疫印迹和 TUNEL 染色结果显示，与 S100A12 低表达的中性粒细胞共培养的心肌细胞凋亡略有减少，而与 S100A12 高表达的中性粒细胞共培养的心肌细胞凋亡显著增加。添加 DNase I 可使高表达 S100A12 的中性粒细胞诱导的心肌细胞凋亡水平恢复正常。这表明中性粒细胞中 S100A12 的表达通过释放 NETs 控制心肌细胞凋亡。
- 内源性 S100A12 通过 NADPH 氧化酶 4（NOX4） - 活性氧（ROS） - pERK 途径促进自杀性 NETosis：研究人员用不同浓度的格列本脲（一种 S100A12 释放抑制剂）处理过表达 S100A12 的中性粒细胞，发现尽管 S100A12 分泌受到抑制，但 NE、MPO 和 citH3 的表达仍显著增加，表明细胞内 S100A12 启动了 NETosis 的形成。进一步研究发现，TG 小鼠来源的原代中性粒细胞中 p - ERK/t - ERK 的比值高于 WT 小鼠，过表达 S100A12 的 dHL - 60 细胞中活性氧（ROS）生成增加，沉默 S100A12 则降低 ROS 生成。添加 ROS 抑制剂 DPI 可剂量依赖性地减少过表达 S100A12 的 dHL - 60 细胞中 NETs 的形成。此外，S100A12 与 NOX4 的相关性更为密切。这些结果表明，内源性 S100A12 通过 NOX4 - ROS - pERK 途径促进自杀性 NETosis。
- 内源性 S100A12 增加中性粒细胞内钙超载：研究人员发现，转染 pcDNA3.1 - S100A12 的细胞中 Rhod2 荧光强度显著增加，表明细胞内钙浓度升高；而转染 si - S100A12 的细胞中 Rhod2 荧光强度下降。钙比色法检测结果也证实了这一点。此外，用离子霉素刺激细胞后，荧光分光光度法检测显示，抑制 S100A12 表达可减少中性粒细胞的钙内流。使用经典的钙通道阻滞剂维拉帕米，可剂量依赖性地减少 S100A12 诱导的 NETs 形成。在 WT 和 TG 小鼠 MI 手术前及术后第 1 天和第 3 天给予维拉帕米，可降低 TG 小鼠 MI 后第 1 天 MPO 和 citH3 的表达，提高 TG 小鼠急性期 MI 后的死亡率和 14 天的心脏功能。这表明内源性 S100A12 通过增加钙内流诱导 NETs 形成。
- Annexin A5（ANXA5）介导 S100A12 诱导的 NETs 形成：通过 TMT 定量蛋白质组学技术，研究人员筛选出 WT 和 TG 小鼠组织中差异表达的蛋白质，发现 ANXA5 在 TG 小鼠中的表达在 mRNA 和蛋白质水平均显著高于 WT 小鼠。在 dHL - 60 细胞中，转染 S100A12 过表达质粒可增加 ANXA5 的表达，沉默 S100A12 则降低其表达。过表达 ANXA5 增加了 NETs 的形成，而阻断 ANXA5 则显著抑制 NETs 的发生。SYTOX Green 染色显示，ANXA5 过表达刺激中性粒细胞产生更多网状 DNA 结构，ANXA5 沉默抑制 S100A12 诱导的 NETs 形成。这些结果表明，ANXA5 介导了 S100A12 诱导的 NETs 形成。
- S100A12 与 ANXA5 相互作用激活中性粒细胞内钙超载：免疫沉淀分析证实 S100A12 与 ANXA5 在 dHL - 60 细胞中直接相互作用。免疫荧光染色显示，转染 pcDNA3.1 - S100A12 后，ANXA5 和 S100A12 在 dHL - 60 细胞的质膜到细胞膜上显著共定位。过表达 ANXA5 显著增加 dHL - 60 细胞中 Rhod2 的荧光强度，表明钙内流增加；而沉默 ANXA5 则阻断钙内流。Fluo - 4 AM 检测也显示，抑制 ANXA5 表达可减少中性粒细胞的钙内流。这表明 S100A12 与 ANXA5 相互作用介导钙内流，诱导 NETs 形成。
- 抑制 ANXA5 减少 S100A12 诱导的 NETs 形成，减轻 MI 损伤：研究人员在 MI 前 3 周给小鼠注射 AAV - shANXA5 以降低 ANXA5 的表达。结果发现，敲低 ANXA5 对 WT 小鼠 MI 后 3 天或 28 天的心脏功能无显著影响，但显著改善了 TG 小鼠梗死后的心脏功能。AAV - shANXA5 处理的小鼠在 MI 后 1 天，凋亡和 NETs 相关蛋白的表达降低，血浆中 dsDNA 浓度降低，NETs 标记物（citH3）的表达也显著减少。这表明抑制 ANXA5 可减少 NETs 的形成，减轻细胞凋亡程度，改善 MI 后的心脏功能。
- 缺氧诱导因子 - 1α（HIF1α）在缺氧和 MI 损伤下调控 S100A12 的表达：HIF1α 是中性粒细胞在缺氧损伤后最迅速诱导的转录调节因子。研究人员发现，随着缺氧时间延长，中性粒细胞中 HIF1α、S100A12、溶菌酶和 NET 相关蛋白的表达增加。沉默 HIF1α 显著降低缺氧后 S100A12 的表达。生物信息学分析显示 S100A12 启动子区域存在 HIF1α 结合位点，构建双荧光素酶报告基因载体实验表明，过表达 HIF1α 显著增加 S100A12 启动子的活性。这表明 HIF1α 在缺氧和 MI 损伤下调控 S100A12 的表达。
- STEMI 患者血浆 dsDNA 浓度与 S100A12 水平相关，可预测 STEMI 后 1 年预后：研究人员分析了 STEMI 患者血浆中 S100A12 水平与 dsDNA、NE 浓度和 PAD4 酶活性的关系，发现血浆 S100A12 浓度与 dsDNA 水平显著相关，而与 NE 血浆浓度和 PAD4 酶活性无显著相关性。根据血浆 dsDNA 水平的三分位数对患者进行分层，发现高 dsDNA 水平患者的糖尿病、高敏肌钙蛋白 T（hscTnT）和 dsDNA 浓度更高。在 1 年的临床随访中，血浆 dsDNA 水平最高三分位数的患者主要不良心血管和脑血管事件（MACCE）发生率最高，全因死亡率也增加。这表明检测早期 AMI 患者血浆中 NETs 成分的变化可能预示不良预后。
综上所述，该研究揭示了 S100A12 在 AMI 中的重要作用机制。在 AMI 发生后，缺氧诱导中性粒细胞中 S100A12 表达迅速增加，S100A12 通过与 ANXA5 相互作用，激活钙内流，促进 NETs 形成，进而加重心肌梗死损伤，影响患者预后。阻断 S100A12 - ANXA5 - 钙超载轴可有效减轻 AMI 后心脏功能的损害。此外，血浆中 S100A12 水平与 dsDNA 浓度的相关性，为 AMI 的诊断和预后评估提供了新的潜在生物标志物。这项研究为 AMI 的治疗提供了新的潜在靶点，有望开发出更有效的治疗策略，改善 AMI 患者的预后，在心血管疾病研究领域具有重要的意义 。
