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为解决急性胰腺炎（AP）发病机制及治疗难题，德国格赖夫斯瓦尔德大学研究人员探究 CST3 在 AP 中的作用。研究发现 CST3 调控 CTSB 和 CTSL 活性，其变化影响 AP 进程。该研究为 AP 治疗提供新靶点，推荐科研读者阅读。
急性胰腺炎（AP）是一种常见且可能致命的胃肠道疾病，全球每年每 10 万人中就有 13 - 45 人发病，它也是胃肠道疾病住院的主要原因之一，给医疗系统带来了沉重的负担。目前，针对 AP 还没有有效的病因治疗方法，这让医生们在面对这种疾病时常常感到棘手。
在 AP 的发病机制中，胰腺自身蛋白酶的自我消化起着关键作用。其中，丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶（trypsin）被认为在 AP 的发病过程中扮演着重要角色。在正常生理条件下，胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原（trypsinogen）会被分选到酶原颗粒中，当它分泌到十二指肠后，会被刷状缘酶肠激酶激活。然而，在 AP 患者中，胰蛋白酶原会在胰腺腺泡细胞内提前激活，这成为了 AP 发病的关键事件。
那么，是什么导致了胰蛋白酶原在胰腺腺泡细胞内提前激活呢？研究发现，溶酶体水解酶组织蛋白酶 B（CTSB）在这个过程中起到了重要作用。动物研究表明，CTSB 是胰腺内胰蛋白酶原的主要激活剂，基因敲除 Ctsb 可以完全阻止胰蛋白酶原的激活。但奇怪的是，在正常生理条件下，CTSB 和胰蛋白酶原虽然共同存在于分泌小室中，却不会导致胰蛋白酶原提前激活，这背后似乎存在着某种调节机制。
除了 CTSB，组织蛋白酶 L（CTSL）也存在于同一分泌小室中，它能够降解胰蛋白酶和胰蛋白酶原，被认为是一种细胞内防止胰蛋白酶原过早激活的 “安全机制”。此外，半胱氨酸蛋白酶抑制剂胱抑素 C（CST3）也存在于腺泡细胞的分泌小室中，它是 CTSB 和 CTSL 的内源性抑制剂。然而，目前对于 CST3 在 AP 发病过程中的具体作用，科学家们还知之甚少。
为了深入了解 CST3 在 AP 发病中的作用机制，德国格赖夫斯瓦尔德大学医学系的 Jana Marielle Modenbach、Christina M?ller 等研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Biochemical analyses of cystatin - C dimers and cathepsin - B reveals a trypsin - driven feedback mechanism in acute pancreatitis” 的论文。他们通过一系列实验，揭示了 CST3 在 AP 发病过程中的重要作用，为理解 AP 的发病机制提供了新的视角。
研究人员在这项研究中，主要用到了以下几种关键技术方法：
- 免疫荧光和蛋白质印迹技术：通过免疫荧光标记和蛋白质印迹分析，研究人员可以确定蛋白质在细胞内的定位以及不同样本中蛋白质的表达情况。
- 酶活性检测技术：利用特定的底物，通过荧光检测的方法来测量 CTSB、CTSL、胰蛋白酶和糜蛋白酶等酶的活性，从而了解这些酶在不同条件下的功能变化。
- 分子动力学模拟技术：借助该技术，研究人员可以模拟蛋白质之间的相互作用，从分子层面解释实验现象，探究 CST3 对 CTSB 和 CTSL 活性调节的机制。
下面我们来详细看看他们的研究结果：
胱抑素 C 定位于胰腺腺泡细胞的分泌小室
研究人员通过对小鼠胰腺切片进行免疫荧光标记，发现 CST3 与 α - 淀粉酶共定位在分泌小室中。同时，对小鼠胰腺组织进行亚细胞分级分离和蛋白质印迹分析也证实，CST3 存在于重组分的细胞器中，也就是酶原颗粒（ZG）。此外，在人类胰腺组织切片和胰腺液样本中，也观察到了类似的结果。而且，研究人员还发现，在胰腺炎期间，CST3 会与 CTSB 和 CTSL 一起重新分布到含有酶原的分泌小室中。这些结果表明，CST3 在胰腺腺泡细胞的分泌小室中发挥着重要作用，就像一个 “守护者”，守护着分泌小室的稳定。
胱抑素 C 缺陷小鼠中的蛋白酶激活
研究人员对 CST3 缺陷小鼠（Cst3?/?）进行了研究。通过蛋白质印迹分析，他们确认了 Cst3?/?小鼠中不存在 CST3。随后，他们测量了不同小鼠品系中胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶的活性，发现野生型和 Cst3?/?小鼠在未处理时，这些酶的含量相似。但是，当用胆囊收缩素（CCK）刺激分离的胰腺腺泡细胞后，Cst3?/?小鼠的腺泡细胞中，CTSB、CTSL、胰蛋白酶和糜蛋白酶的蛋白酶激活水平明显更高。此外，在胰腺炎期间，Cst3?/?小鼠的酶原颗粒中，CTSB 和 CTSL 的活性也显著增加。这些结果说明，CST3 在抑制酶原颗粒中 CTSB 和 CTSL 的活性方面起着重要作用，它就像是一个 “刹车”，阻止这些酶过度激活，一旦这个 “刹车” 失灵，酶的活性就会失控。
胰腺炎期间胱抑素 C 对蛋白酶活性的调节
研究人员发现，胰腺炎诱导后，在轻度酸性至中性 pH 范围（6 - 7）内，野生型小鼠酶原颗粒中的 CTSB 活性会增加，而在 Cst3?/?小鼠中则没有这种变化。这表明胰腺炎诱导后，CST3 对 CTSB 的抑制能力可能会丧失。进一步研究发现，胰蛋白酶能够切割 CST3，切割后的 CST3 对 CTSB 的抑制能力下降，反而会增加 CTSB 的活性，而对 CTSL 的抑制能力则不受影响。这就好比 CST3 这个 “守护者” 被胰蛋白酶 “改造” 后，不仅不再抑制 CTSB，反而成为了 CTSB 的 “助力器”，但对 CTSL 的抑制作用依然存在。
胰蛋白酶介导的胱抑素 C 切割
为了探究胰蛋白酶切割 CST3 的具体机制，研究人员通过 Western blot 分析和 LC - ESI - MS/MS 分析，确定了 CST3 上的胰蛋白酶切割位点为 K24 和 R28。他们还发现，CST3 在酸性条件下更容易二聚化，二聚化后的 CST3 会显著增加 CTSB 的活性。而且，胰蛋白酶介导的 CST3 切割会进一步促进其在较高 pH 值下的二聚化。这就像是胰蛋白酶给 CST3 发出了一个 “信号”，让它更容易形成二聚体，从而影响 CTSB 的活性。
加工后的胱抑素 C 对 CTSB 和 CTSL 的影响
研究人员利用分子动力学模拟技术，发现 CTSB 有一个特殊的自抑制机制，即其封闭环会覆盖活性位点，防止底物结合和蛋白水解。而二聚化的 CST3 无法像单体那样结合到 CTSB 的抑制位置，但会与 CTSB 的一个未知口袋结合，从而稳定封闭环的开放位置，增加 CTSB 的活性。这就好比二聚化的 CST3 找到了 CTSB 的一个 “秘密开关”，打开这个 “开关” 后，CTSB 的活性就被大大增强了。
AP 在 Cst3?/?小鼠中的疾病严重程度增加
研究人员通过给 Cst3?/?小鼠和野生型小鼠注射雨蛙素诱导 AP，发现 Cst3?/?小鼠的胰腺组织损伤更严重，血清淀粉酶活性更高，胰腺内胰蛋白酶原激活增加，促炎细胞因子水平升高，抗炎细胞因子水平降低，肺组织中的髓过氧化物酶（MPO）活性也更高，这表明 CST3 在 AP 的疾病进展中起着重要的调节作用，缺乏 CST3 会使 AP 病情更加严重。就像失去了 CST3 这个 “保护盾”，小鼠在面对 AP 时变得更加脆弱，病情也更加难以控制。
人类 CST3 基因的遗传变异
研究人员分析了胰腺炎患者和健康对照人群中 CST3 基因的序列变异情况，虽然发现了一些变异，但这些变异与慢性胰腺炎之间并没有显著的关联。这意味着目前还不能确定 CST3 基因的遗传变异在慢性胰腺炎的发病机制中起到重要作用，还需要进一步的研究来探索。
总的来说，这项研究表明，CST3 作为 CTSB 和 CTSL 的内源性抑制剂，在胰腺腺泡细胞的分泌小室中调节组织蛋白酶的活性。在正常生理条件下，CST3 能够抑制 CTSB 的活性，防止胰蛋白酶原过早激活。然而，在 AP 发病过程中，分泌小室的酸化会导致 CST3 的抑制能力下降和二聚化，同时胰蛋白酶切割 CST3，使其从 CTSB 的抑制剂转变为激活剂，进而促进胰蛋白酶原的激活，推动 AP 的发病进程。虽然研究人员在人类 CST3 基因中没有发现与慢性胰腺炎显著相关的遗传变异，但这并不意味着 CST3 与胰腺炎毫无关系，未来还需要更大规模的队列研究来进一步探索。
这项研究的意义重大，它为 AP 的发病机制提供了新的见解，揭示了一种不依赖于 CTSB 错误分选或酶原颗粒与溶酶体融合的细胞内蛋白酶激活机制。这就像是为我们打开了一扇通往 AP 发病机制深处的大门，让我们看到了以前未曾了解的细节。这些发现为未来开发针对 AP 的治疗方法提供了潜在的靶点，也许在不久的将来，医生们就能根据这些研究成果，找到更好的治疗 AP 的方法，帮助那些深受 AP 困扰的患者。
