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为解决人类心脏再生难题，乌尔姆大学的研究人员开展斑马鱼心脏再生机制研究。他们发现 BMP 信号通路可缓解 CM 复制应激促进心脏再生，且该功能在哺乳动物中保守。这为心脏疾病治疗和抗衰研究提供新思路，值得科研人员阅读。
在心血管疾病的研究领域，心肌梗死一直是人类健康的一大杀手。人类的心脏和大多数成年哺乳动物一样，在心肌细胞（Cardiomyocytes，CMs）受损后，缺乏有效的自我修复能力，无法及时补充因损伤而丢失的 CMs。然而，神奇的是，成年斑马鱼却拥有令人惊叹的心脏再生能力，它们能通过伤口边缘成熟 CMs 的去分化和增殖，高效且完整地修复心脏损伤。在面对冷冻损伤导致三分之一心室 CMs 死亡的情况时，斑马鱼能在 30 天内恢复到受伤前的 CMs 数量。这一巨大差异吸引了众多科研人员的目光，他们渴望揭开斑马鱼心脏再生的神秘面纱，探寻其中隐藏的机制，希望能为人类心脏疾病的治疗找到新的方向。
之前的研究发现，许多信号通路都与斑马鱼 CMs 的去分化和细胞周期调控有关。其中，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路在心脏再生过程中对 CMs 的去分化和增殖起着重要作用，但在生理心脏生长过程中却没有明显作用，这表明 BMP 信号通路主要作用于再生特异性的细胞过程。然而，斑马鱼心脏再生过程中还有许多关键问题尚未得到解答，比如 CMs 在再生过程中是否会面临特殊的挑战？BMP 信号通路又是如何具体调控 CMs 再生的呢？
为了深入探究这些问题，来自乌尔姆大学（Ulm University）的 Mohankrishna Dalvoy Vasudevarao、Denise Posadas Pena 等研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “BMP signaling promotes zebrafish heart regeneration via alleviation of replication stress” 的论文。他们通过一系列实验，得出了令人瞩目的结论：BMP 信号通路通过缓解复制应激，促进了斑马鱼心脏的再生，并且这一功能在哺乳动物细胞中也是保守的。这一发现为理解心脏再生机制以及开发潜在的治疗策略提供了重要的理论依据。
研究人员为了开展这项研究，用到了几个主要关键的技术方法。首先是基因编辑技术，通过构建转基因和突变体斑马鱼模型，来操控 BMP - Smad 信号通路；其次是分子生物学技术，像 qRT - PCR（实时定量聚合酶链式反应）用于检测基因表达水平，Western blot（蛋白质免疫印迹）用于分析蛋白质表达量；还有细胞生物学技术，例如免疫荧光染色来观察细胞内的分子标记，DNA 纤维铺展实验研究 DNA 复制动态等。
下面我们来详细看看他们的研究结果：
心肌细胞在斑马鱼心脏再生过程中 γH2a.x 呈阳性
研究人员在探索心脏再生机制时，对斑马鱼心脏进行了转录组分析。他们发现，与 DNA 修复相关的基因特征在损伤后 7 天（dpi）显著富集，而这个时间点恰好是 CMs 增殖的高峰期。通过 qRT - PCR 进一步证实，多个 DNA 损伤反应通路中的基因在冷冻损伤后 7 dpi 的心室中表达上调。利用单细胞测序数据，研究人员还发现，一些上调的 DNA 修复相关基因在伤口边缘区域的 CMs 中表达更强。这一系列发现让他们猜测，伤口边缘的 CMs 可能存在 DNA 损伤。于是，他们用一种针对组蛋白变体 H2a.x 磷酸化形式（γH2a.x，一种已被广泛认可的 DNA 损伤标记）的抗体进行检测。Western blotting 检测发现，在 7 dpi 时，心室组织（去除伤口以富集 CMs）中的 γH2a.x 水平升高；免疫荧光结果显示，7 dpi 时伤口边缘（距离伤口 150 μm 以内）有相当一部分 CMs 的 γH2a.x 呈阳性。而且，γH2a.x 阳性的时间变化曲线与处于细胞周期的 CMs 比例变化曲线相似，都是在 7 dpi 达到峰值，30 dpi 恢复到基线水平。此外，γH2a.x 阳性 CMs 的数量还随着与伤口距离的增加而减少。在心室尖端切除的再生心脏中也观察到了 γH2a.x 阳性的 CMs。这些数据表明，再生心脏中的 CMs 确实经历了 DNA 损伤，而且这种损伤与损伤类型无关，也不太可能是由损伤直接导致的。
研究人员还考虑到，在小鼠中，出生后氧气张力的升高会导致 DNA 损伤，进而限制 CMs 的增殖。那么在斑马鱼心脏再生过程中，氧化应激是否也会诱导 CMs 的 DNA 损伤呢？他们通过 ELISA（酶联免疫吸附测定）检测 8 - 羟基 - 2’ - 脱氧鸟苷（8 - OHdG）来评估氧化 DNA 损伤。结果发现，过氧化物处理心脏外植体会诱导 DNA 氧化，但冷冻损伤单独并不会使 8 - OHdG 水平相较于未受伤心脏增加。这说明氧化 DNA 损伤不太可能是 CMs 中 γH2a.x 阳性的原因。
心肌细胞在再生过程中经历复制应激，但在生理心脏生长过程中不会
γH2a.x 积累的时间和空间分布特征表明，进入细胞周期的伤口边缘 CMs 可能经历了 DNA 损伤。为了验证这一猜想，研究人员用 EdU（5 - 乙炔基 - 2’ - 脱氧尿苷）标记处于细胞周期的 CMs，并在 7 dpi 时对 γH2a.x 和 EdU 进行染色。他们发现，约 55% 的 EdU 阳性 CMs 同时也是 γH2a.x 阳性，反之，81% 的 γH2a.x 阳性 CMs 是 EdU 阳性。这表明 CMs 在再生过程中进入细胞周期时会经历复制应激，从而导致 γH2a.x 阳性。
为了进一步探究在生理心脏生长过程中，循环的 CMs 是否也会积累 γH2a.x，研究人员用 8 h 的 EdU 脉冲标记幼鱼（受精后 30 天，体长 16 mm）未受伤心脏中的 CMs，并对 γH2a.x 进行染色。结果显示，只有 0.62% 的 CMs 是 γH2a.x 阳性，而用羟基脲（HU，一种能消耗细胞核苷酸从而导致复制应激的物质）处理后，γH2a.x 阳性的 CMs 明显积累。在成年冷冻损伤的心脏中，HU 处理同样增加了 γH2a.x 阳性 CMs 的比例，但却减少了 CMs 的细胞周期和同时为 γH2a.x 阳性和 EdU 阳性的 CMs 比例。这些数据充分表明，γH2a.x 通常不会标记循环的斑马鱼心肌细胞，但它是复制应激的可靠指标。此外，研究人员还发现，未受干扰的再生心脏中 84% 的 γH2a.x 阳性 CMs 呈现全核 γH2a.x 分布，并且磷酸化的 Rpa32（p - Rpa32，单链 DNA 结合蛋白 RPA 复合物的一部分，其积累被认为是复制应激的特异性指标）水平在 7 dpi 时在心肌心室组织中显著增加。综合这些结果，研究人员得出结论：伤口边缘的 CMs 经历了复制应激，这种应激可以通过 γH2a.x 的积累来检测。
研究人员还发现，心脏再生诱导的复制应激与 CMs 的细胞周期密切相关。比如，单次注射维生素 D 类似物骨化二醇，能增强心脏再生，同时增加 7 dpi 时伤口边缘有丝分裂的磷酸化组蛋白 H3（pH3）阳性 CMs 的比例，并且 γH2a.x 阳性 CMs 的比例也有增加的趋势。用 mTOR 抑制剂雷帕霉素处理，或者让斑马鱼处于饥饿状态，都会减少 7 dpi 时循环 CMs 和 γH2a.x 阳性 CMs 的比例。用 CDK4/6 抑制剂 PD - 0332991 直接抑制细胞周期进程，也能显著降低 7 dpi 时有丝分裂的 pH3 阳性 CMs 和 γH2a.x 阳性 CMs 的数量。在幼鱼中，通过改变饲养密度来调节心脏生长速率（即生理 CMs 循环速率），发现刺激生长条件会增加增殖细胞核抗原（PCNA）阳性 CMs 的比例，但不会诱导 γH2a.x 阳性 CMs 的积累，而当幼鱼心脏受伤时，γH2a.x 阳性 CMs 就会积累。这些结果都有力地支持了 CMs 复制应激是由再生需求特异性诱导，而非生理生长诱导的结论。
另外，研究人员还探究了复制应激对 CMs 去分化的影响。他们发现，通过 HU 处理诱导外源性复制应激，并不会影响 CMs 去分化的三个指标，即 CM 祖细胞标记基因 gata4 调控区域活性报告转基因的上调、胚胎肌球蛋白（embMHC）的上调以及肌节的解体。这表明 CMs 的去分化独立于复制应激发生，并且可能在 CMs 细胞周期之前发生，而 HU 处理会减少 CMs 细胞周期。
DNA 损伤信号对心脏再生至关重要
经历复制应激的 CMs 会怎样呢？研究人员想知道它们是否会进入衰老或凋亡状态。在 7 dpi 时，衰老标记物 β - 半乳糖苷酶在伤口区域的表达上调，但表达位置似乎是心外膜细胞，而非 CMs。有趣的是，用 HU 处理 7 天诱导外源性复制应激，也不足以在 7 dpi 时诱导 CMs 衰老。这说明经历复制应激的 CMs 不会进入衰老状态。在未受干扰的再生心脏中，只有 0.27% 的伤口边缘 CMs 通过 Caspase3 积累检测为凋亡，而电离辐射会诱导 CMs 凋亡。这些结果表明，斑马鱼经历复制应激的 CMs 最终能够克服这种应激并继续增殖，尽管它们保留了对 DNA 损伤诱导促凋亡信号的能力。
既然如此，检测复制应激的 DNA 损伤通路可能对心脏再生至关重要。研究人员首先测试了 ATM 和 ATR 激酶抑制剂在斑马鱼中的功能。这两种激酶分别介导细胞对 DNA 损伤和复制应激的反应。他们发现，ATM 抑制剂 KU55933 和 ATR 抑制剂 VE821 对斑马鱼胚胎发育没有毒性，但用 ATR 抑制剂处理的胚胎在接触对自身影响较小的 HU 剂量时会出现坏死，ATM 抑制剂则会加剧低剂量电离辐射的影响。这表明这些抑制剂会阻断斑马鱼细胞在面对复制应激和其他形式 DNA 损伤时激活修复通路的能力。研究还发现，用 ATR 抑制剂 VE821 处理斑马鱼 24 h，就足以减少 7 dpi 时再生心脏中 CMs 的有丝分裂。由于 ATM 和 ATR 激酶通路可以相互作用促进复制应激反应，同时使用 ATM 和 ATR 抑制剂会比单独使用 ATR 抑制剂更强烈地抑制 CMs 的有丝分裂，并且还会损害心脏的形态再生，比如伤口收缩程度在 3 - 21 dpi 时明显减小。这些数据充分表明，主要由 ATR 介导、ATM 参与的 DNA 损伤修复通路的激活，对再生 CMs 的增殖和心脏再生至关重要。
BMP 信号通路缓解 CM 复制应激
前面提到，缓解复制应激对 CMs 的高效再生至关重要。研究人员推测，斑马鱼心脏促再生信号环境中的特定成分可能通过影响 CM 复制应激来促进再生。BMP 信号通路是一个很有潜力的候选者，因为它在斑马鱼心脏再生过程中被激活，但在生理生长条件下却没有，并且对再生 CMs 的增殖至关重要。
为了验证 BMP 信号通路是否调节 CM 复制应激，研究人员利用热休克诱导的转基因技术，过表达分泌型抑制剂 Noggin3（nog3），它可以干扰 BMP 配体与受体的结合，阻断 Smad 依赖和 Smad 非依赖的非经典 BMP 信号通路。结果发现，与热休克处理的野生型斑马鱼相比，表达 nog3 的斑马鱼在 7 dpi 时 γH2a.x 阳性 CMs 的比例显著增加；而通过 hsp70l:bmp2bfr13Tg 鱼过表达 BMP 配体 bmp2b，则能有效减少 γH2a.x 阳性 CMs 的数量。重要的是，单次脉冲诱导 bmp2b 过表达，就能在 6 h 内显著减少 γH2a.x 阳性 CMs 的数量，这表明 BMP 信号通路可以直接作用于经历复制应激的循环 CMs。
研究人员还发现，Bmp7a 在缓解 CM 复制应激过程中起着不可替代的作用。过表达 bmp7b 或 bmp4 也能减少 γH2a.x 阳性 CMs 的比例，而 bmp7a 基因纯合突变的斑马鱼在 7 dpi 时，γH2a.x 阳性 CMs 的比例增加，同时 p - Smad1/5/9 水平降低，但突变体和野生型心脏在形态上没有差异。此外，在 HU 处理的斑马鱼中，nog3 过表达会进一步增加 γH2a.x 阳性 CMs 的比例，而 bmp2b 过表达则能显著降低这一比例。这些结果都表明，内源性 BMP 信号通路在再生过程中对缓解 CM 复制应激是必需的。
BMP 通过 Smads 抑制复制应激
BMP 配体可以激活 Smad 依赖和非依赖（非经典）的信号通路。研究人员想知道 BMP 在缓解斑马鱼心脏复制应激过程中是否通过 Smads 起作用。他们构建了一种转基因斑马鱼品系，在热休克后表达抑制性 Smad6b 和核番茄红素（nT）。结果发现，在 7 dpi 热休克 6 h 后，nT 阳性的 CMs 中，磷酸化 Smad1/5/9 的核积累减少，同时 γH2a.x 阳性的频率是野生型或 nT 阴性 CMs 的 3 倍。这表明 BMP/Smad 信号通路在 CMs 中细胞自主地缓解复制应激是必需的。
为了进一步探究过表达的 BMP 配体是否仅通过 Smad 通路起作用，研究人员分析了同时转基因表达 hsp70l:bmp2b 和 hsp70l:nT - p2a - smad6b 的斑马鱼。正如预期的那样，bmp2b 过表达会增加 p - Smad1/5/9 阳性 CMs 的比例，而 smad6b 会降低这一比例，在双转基因鱼中，p - Smad1/5/9 阳性 CMs 的比例与野生型相当。同时，他们发现，虽然单独表达 bmp2b 会显著减少 γH2a.x 阳性 CMs 的数量，但与 smad6b 共表达时，这种效果完全消失。这些数据表明，BMP 信号通路直接在 CMs 中通过 Smads 来缓解复制应激。
研究人员还研究了抑制 BMP/Smad 信号通路对心脏形态再生和瘢痕形成的长期影响。他们对冷冻损伤的 hsp70l:nT - p2a - smad6b 转基因斑马鱼和野生型同胞进行 21 天的每日热休克处理，并用酸性品红橙 G（AFOG）染色评估伤口大小和胶原蛋白沉积。结果发现，在 3 dpi 时，伤口大小没有差异，但在 21 dpi 时，hsp70l:nT - p2a - smad6b 冷冻损伤的心脏伤口更大，并且含有更多的胶原蛋白。这表明 BMP/Smad 信号通路对心脏形态再生和瘢痕消退是必需的。
BMP 信号通路促进无应激复制并进入有丝分裂
BMP 信号通路在调节再生 CMs 的循环和增殖方面似乎有独特的作用。研究人员发现，BMP 信号通路的行为与其他改变 CMs 细胞周期和增殖的干预措施不同。例如，在各种实验干预中，循环 CMs 的比例与 γH2a.x 阳性 CMs 的比例密切正相关，但 bmp7a 基因缺失会减少 CMs 的循环，却增加 γH2a.x 阳性 CMs 的比例。
研究人员进一步探究 BMP 信号通路是如何调节再生 CMs 的循环和增殖的。他们发现，单次脉冲表达 smad6b 会在 6 h 内减少冷冻损伤的 hsp70l:nT - p2a - smad6b 斑马鱼中 pH3 阳性有丝分裂 CMs 的比例。通过标记循环 CMs 并对 EdU 和 PCNA 进行染色，他们发现抑制 BMP 信号通路（通过过表达 nog3）会增加 7 dpi 时 EdU 阳性且 PCNA 阳性的 CMs 比例，这表明细胞周期出现延迟。同时，过表达 nog3 还会增加 EdU 阳性且 γH2a.x 阳性的应激 CMs 比例，bmp7a 基因敲除的斑马鱼也有类似的现象。这些数据表明，BMP 信号通路通过帮助 CMs 克服复制应激并进入有丝分裂，从而促进 CMs 的增殖。
相反，过表达 bmp2b 虽然在正常情况下不能减少 PCNA 阳性且 EdU 阳性的 CMs 比例，但能缓解 HU 处理导致的这一比例的增加，并且能增加正常和 HU 诱导应激条件下 EdU 阳性且 γH2a.x 阴性的无应激复制 CMs 的比例。这进一步证明了 BMP 信号通路在促进无应激复制和细胞周期进展方面的作用。
BMP 信号通路保护小鼠心肌细胞和人类细胞免受复制应激
BMP 信号通路缓解复制应激的能力在哺乳动物中是否也保守呢？研究人员对此进行了探究。新生小鼠在出生后的短时间内具有心脏再生能力，出生后第 1 天（P1）的小鼠心肌细胞在培养中仍保留增殖能力。研究人员发现，用重组 BMP2 或 BMP7 蛋白处理，在没有 HU 处理时，不会影响 γH2a.x 阳性 CMs 的基础数量，但能消除 HU 诱导的 γH2a.x 积累。这表明 BMP2 和 BMP7 能保护新生小鼠心肌细胞免受 HU 诱导的复制应激。与之对比，p38 激酶抑制剂 SB202190 则不能保护心肌细胞免受 HU 诱导的复制应激，这说明缓解复制应激是 BMP 信号通路的一个独特特征。
在人类细胞实验中，研究人员发现，在人骨肉瘤细胞系 U2OS 中，联合使用重组 BMP2 和 BMP4 蛋白，能完全消除 HU 处理诱导的 γH2a.x 表达；在新生儿人包皮真皮成纤维细胞中，BMP2 和 BMP4 处理也能抑制 HU 诱导的 γH2a.x 表达，但不会增强细胞复制。此外，BMP 信号通路还能保护造血干细胞免受复制应激诱导的功能衰退。用 HU 处理 4 h 会显著降低原代人骨髓 CD34 + 造血干细胞和祖细胞（HSPCs）形成克隆集落的能力，而在 HU 处理前用 BMP2 预处理 2 h，就能使集落形成单位（CFU）数量恢复到未用 HU 处理的 HSPCs 水平。这些数据充分表明，缓解复制应激是 BMP 信号通路在多种细胞类型和
