整合应激响应调控哺乳动物18S非功能性rRNA降解的分子机制解析

本研究揭示了哺乳动物细胞通过GCN2-RNF10-RIOK3轴监测核糖体功能的动态反馈机制。研究人员发现解码缺陷的核糖体通过激活整合应激响应(ISR)，减少43S前起始复合物(PIC)与停滞核糖体的碰撞，促进RNF10介导的泛素化和RIOK3依赖的18S rRNA降解。该发现为理解核糖体质量控制提供了新视角，对翻译相关疾病治疗具有潜在意义。

　　

在细胞生命活动中，核糖体作为蛋白质合成的"分子工厂"，其质量控制机制至关重要。有趣的是，虽然酵母中已发现非功能性rRNA降解(NRD)途径，但哺乳动物中这一过程的调控机制长期是个谜团。更令人困惑的是，当核糖体解码中心发生突变时，细胞如何识别这些"故障机器"并启动降解程序？这些问题不仅关乎基础生物学认知，也对理解多种翻译相关疾病具有重要意义。

美国国家癌症研究所的研究团队在《Molecular Cell》发表的研究，首次系统阐明了哺乳动物18S NRD的分子机制。研究人员通过构建正交18S rRNA表达系统，结合CRISPR筛选、选择性核糖体图谱和纳米孔测序等技术，发现解码缺陷的核糖体主要停滞在翻译起始位点，通过GCN2激酶激活整合应激响应(ISR)。这种响应精细调控翻译起始水平，避免43S前起始复合物(PIC)与停滞核糖体碰撞，为RNF10介导的泛素化创造有利条件。最终，非典型激酶RIOK3识别泛素化的40S亚基，启动18S rRNA从5'端、中央和3'端小域的降解。

关键技术方法包括：1)构建带tMS2标签的正交18S rRNA表达系统；2)基于细胞适应性的全基因组CRISPR筛选；3)选择性核糖体图谱分析翻译停滞特征；4)纳米孔长读长测序鉴定18S rRNA降解中间体；5)定量质谱分析蛋白质相互作用网络。

研究结果部分，"解码缺陷核糖体主要在翻译起始位点停滞"显示，通过选择性核糖体图谱分析发现，携带A1824C突变的18S rRNA形成的核糖体在起始密码子区域富集程度比野生型高7倍，且在上游开放阅读框(uORF)起始位点也有类似停滞现象。"GCN2及其效应分子是18S NRD必需组分"部分证实，CRISPR筛选将GCN2确定为最显著的候选基因，敲除GCN2使18S:A1824C rRNA水平增加约3倍，而回补野生型而非激酶死亡突变体(Km)可恢复降解活性。"解码缺陷核糖体触发GCN2依赖性elF2α磷酸化而不诱导核糖体碰撞"揭示，二甲基硫酸(DMS)探测显示突变核糖体A位点(腺苷酸1825位)可及性增加27倍，但未检测到80S-80S碰撞特征。"GCN2通过精细调控翻译起始确保18S NRD"部分发现，适度而非高水平的elF2αS51D磷酸化模拟物能最佳促进18S NRD，形成"V型"剂量反应曲线。"GCN2缺失加剧起始密码子停滞导致43S-80S碰撞"通过足迹分析显示，GCN2敲除使43S-80S碰撞复合物(~57 nt)在起始位点富集，间距约19个密码子。"GCN2-RNF10轴依赖的解码缺陷核糖体泛素化"证明，RNF10敲除使18S:A1824C rRNA稳定4倍，质谱分析显示RNF10KO背景下uS3泛素化显著降低。"非典型激酶RIOK3结合泛素化40S亚基"通过免疫沉淀-质谱将RIOK3鉴定为与泛素化40S亚基相互作用的关键因子，且该结合依赖uS3/uS5的泛素化。"RIOK3 UIM和激酶活性对18S NRD至关重要"显示，缺失泛素相互作用模体(UIM)或激酶活性突变(Km1)的RIOK3无法挽救降解缺陷。"18S NRD中间体的特征鉴定"通过纳米孔测序发现降解主要从18S rRNA的5'端、中央和3'端小域起始，这些中间体在GCN2KO、RNF10KO和RIOK3KO背景下显著减少。

研究结论指出，哺乳动物细胞通过GCN2-RNF10-RIOK3轴形成动态反馈环路，监测起始阶段的核糖体功能。解码缺陷核糖体停滞产生的空载A位点激活GCN2，引发elF2α磷酸化和翻译起始抑制，避免43S PIC与停滞核糖体碰撞。这种调控使RNF10能够有效标记缺陷核糖体进行泛素化，随后RIOK3通过UIM识别泛素化40S亚基，其激酶活性促进18S rRNA降解。该研究不仅首次在哺乳动物中系统阐明18S NRD机制，还揭示了翻译起始调控与核糖体质量控制之间的精密偶联，为理解蛋白质合成保真度维持提供了新范式，对核糖体病变等相关疾病研究具有重要启示。