膜结合型 SCOTIN 凝聚物通过隔离腔内 BiP 引发内质网应激反应：细胞命运调控的新机制

为探究 SCOTIN 在细胞存活与死亡调控中的作用，研究人员开展了关于 SCOTIN 激活内质网应激反应（ER stress response）机制的研究。结果发现，SCOTIN 过表达形成的凝聚物可引发 ER stress，通过隔离 BiP 激活未折叠蛋白反应（UPR）。该研究揭示了细胞应激调控新机制，具有重要意义。

　　在细胞的微观世界里，内质网（ER）就像一座繁忙的工厂，承担着蛋白质合成、脂质代谢等诸多重要任务。然而，当细胞面临各种压力时，这座 “工厂” 就会出现 “故障”，引发内质网应激反应。内质网应激反应对细胞来说至关重要，它掌控着细胞是生存还是走向死亡的命运抉择。但目前，对于其中的调控机制，科学家们还没有完全弄清楚。

SCOTIN 作为一种在 DNA 损伤或干扰素刺激时表达会增加的蛋白质，之前的研究发现它与细胞凋亡有关，比如在 γ - 射线照射的小鼠成纤维细胞以及肥胖小鼠的胰腺 β 细胞凋亡过程中都有它的身影 。但 SCOTIN 在细胞存活与死亡调控中的具体作用和机制，依旧是个未解之谜。在观察 SCOTIN 凝聚物时，研究人员还发现内质网的形态发生了明显改变，这一现象引发了大家的好奇：SCOTIN 凝聚物是否在 ER stress 反应中发挥着某种作用呢？为了揭开这些谜团，来自韩国浦项科技大学（Pohang University of Science and Technology）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Reports》上，为我们理解细胞应激反应机制带来了新的曙光。

研究人员为了深入探究相关机制，采用了多种关键技术方法。在细胞模型构建方面，利用 CRISPR-Cas9 技术构建了 SCOTIN 基因敲除（KO）的 HeLa 细胞系。检测基因和蛋白表达时，运用 RNA 分离和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫印迹（Immunoblotting）技术 。研究蛋白之间相互作用，使用了共免疫沉淀（coIP）技术。观察细胞和蛋白的微观结构与动态变化，则借助了荧光显微镜、共聚焦显微镜技术，还有荧光漂白恢复（FRAP）实验、相关光电子显微镜（CLEM）及三维重建、透射电子显微镜（TEM）技术等。

研究结果如下：

• SCOTIN 过表达诱导细胞死亡并激活内质网应激反应：研究人员发现，HeLa 细胞中过表达 SCOTIN 后，会发生凋亡，PARP1 在转染 24 小时后出现裂解，并且持续到 60 小时，同时检测到 cleaved caspase-3 和 caspase-8。进一步研究发现，SCOTIN 过表达还会激活 UPR，表现为 XBP1^s、CHOP 等相关蛋白水平显著升高，IRE1α、PERK、ATF6α 等内质网应激传感器蛋白也被激活。与已知的内质网应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin）处理结果对比，发现 SCOTIN 过表达引发的 UPR 激活程度与之相当 。通过监测 IRE1α 的寡聚化，发现约 63% 的 SCOTIN-MYC 表达细胞出现 IRE1 焦点，且这些细胞中部分还含有 SCOTIN 斑点，不过 IRE1 焦点与 SCOTIN 斑点并非完全共定位。此外，研究还发现过表达的 SCOTIN 可间接将应激颗粒（SGs）与 IRE1 联系起来123。
• SCOTIN 凝聚对诱导内质网应激至关重要：研究人员通过研究不能凝聚的 SCOTIN（Δ150–177）-MYC 突变体，发现其过表达几乎不能诱导 UPR，产生的 IRE1 焦点数量也显著少于正常 SCOTIN 过表达的细胞。在单细胞水平监测 XBP1 剪接时发现，SCOTIN（Δ150–177）-MYC 转染后，F-XBP1^DDBD-Venus 的产生被消除。由此得出结论，SCOTIN 在 ER 上凝聚的能力对于 UPR 的激活至关重要456。
• 具有 SCOTIN 凝聚物的细胞出现细胞应激的形态学迹象：利用 CLEM 分析表达 SCOTIN-TC 的细胞超微结构，发现 SCOTIN-TC 凝聚物呈不规则形状，被多条 ER 膜包围，还观察到一些小的 SCOTIN-TC 斑点位于细胞器之间的胞质空间。在有较大凝聚物的细胞中，出现了 ER 扩张、线粒体碎片化、高尔基体肿胀等细胞器结构的严重改变。通过 TEM 观察 SCOTIN-APEX2 过表达的细胞，也发现了受损 ER 的清除以及细胞器的异常形态变化，这些都表明细胞处于严重应激状态789。
• 内质网伴侣蛋白 BiP 被隔离在固定的 SCOTIN 凝聚物中：研究人员起初假设 IRE1 可能直接被 SCOTIN 凝聚物激活，但通过共染色发现 IRE1 和 SCOTIN 斑点很少共定位，否定了这一假设。随后提出新假设，即控制 IRE1 寡聚化的关键细胞成分被隔离在 SCOTIN 斑点中。由于 BiP 从 IRE1 上解离是 IRE1 等应激传感器寡聚化的前提，所以研究人员猜测 BiP 被隔离在 SCOTIN 凝聚物中会促进 IRE1 寡聚化。实验结果显示，SCOTIN-MYC 斑点与 BiP 共定位，而与另一种内质网伴侣蛋白 GRP94 几乎不共定位，且 BiP 与 SCOTIN（Δ150–177）-MYC 很少共定位 。FRAP 实验表明，在 SCOTIN 斑点中 BiP 的流动性明显降低，说明含有 SCOTIN 和 BiP 的凝聚物是固定的101112。
• PRD 介导的凝聚是 SCOTIN 与腔内 BiP 发生物理相互作用所必需的：通过 coIP 实验证实，SCOTIN-MYC 表达细胞与内源性 BiP 存在明显的物理相互作用。研究发现，BiP 可能通过其底物结合结构域（SBD）识别并结合 SCOTIN 腔内结构域中部分折叠或未折叠的区域，尤其是半胱氨酸富集结构域（CRD）。当 SCOTIN 发生不能凝聚的突变（如 Δ150–177）时，与 BiP 的物理相互作用消失。此外，构建一系列 SCOTIN CRD 缺失突变体进行实验，结果表明，胞质中 PRD 介导的 SCOTIN 凝聚是其与腔内 BiP 结合的前提条件131415。
• PRD 介导的凝聚和 BiP 隔离与内质网应激反应的诱导在功能上相关：研究人员发现，大多数 SCOTIN CRD 突变体形成的点状结构能与内源性 BiP 共定位，即使在 coIP 实验中未检测到物理相互作用 。但 SCOTIN 凝聚物在 ER 膜上的形成是 BiP 被隔离在其中的前提，当突变导致 SCOTIN 无法形成大的凝聚物时，与 BiP 的共定位也会消失。分析不同 SCOTIN CRD 突变体细胞中 XBP1^s的产生和 CHOP 的诱导情况，发现除部分突变体（如 C1 和 C2）外，大多数突变体的 XBP1 剪接水平与野生型相当，但 Δ150–177 突变会显著降低 XBP1 和 CHOP 的产生，这再次证实了 SCOTIN 通过胞质 PRD 凝聚对 BiP 隔离和内质网应激反应诱导的重要性。研究还发现，仅添加 150 - 177 aa 不足以完全恢复 ER stress 反应，且用其他具有凝聚形成潜力的蛋白替代 SCOTIN 的 PRD 也不能诱导 ER stress 反应161718。

研究结论和讨论部分指出，本研究表明 ER 膜上 SCOTIN 凝聚物的存在可通过隔离腔内 BiP 蛋白诱导内质网应激。SCOTIN 的胞质 PRD 和腔内 CRD 对于介导凝聚物诱导的内质网应激都非常必要。研究人员推测，PRD 在胞质中的凝聚会跨膜传递信号，导致腔内 CRD 结构发生异常转变，进而招募 BiP 并激活内质网应激反应。这一过程类似于细胞膜上配体 - 受体相互作用后信号跨膜转导激活下游通路。关于 SCOTIN 与 BiP 形成复合物的机制，研究人员提出了三种可能的相互作用模式：一是 SCOTIN CRD 与 BiP SBD 直接结合；二是胞质凝聚诱导 SCOTIN CRD 结构改变，暴露疏水区域与 BiP 相互作用；三是可能存在适配蛋白介导二者间接结合 。通过 AlphaFold2 建模，研究人员对 SCOTIN 与 BiP 的相互作用有了更深入的了解，发现 PRD 对 SCOTIN 的正确折叠和被 BiP 识别至关重要。此外，研究还发现 SCOTIN 可能存在多种状态，其凝聚物形成或许是细胞在应激条件下维持内稳态、平衡细胞生死的一种防御机制 。不过，该研究也存在一定的局限性，比如目前无法在不标记的情况下可视化内源性 SCOTIN，且不同细胞系中 SCOTIN 的基础水平、诱导性以及细胞对刺激的凋亡反应存在差异 。但总体而言，这项研究为深入理解内质网应激反应的调控机制提供了重要依据，为后续相关领域的研究奠定了坚实基础，有望为相关疾病的治疗和干预开辟新的方向。