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为探究内体 pH 如何参与 α- 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸受体（AMPAR）转运，约翰霍普金斯大学医学院研究人员开展关于质子激活氯离子（PAC）通道的研究。结果发现，PAC 调节神经元内体 pH，缺失会损害 AMPAR 内吞和长时程抑制（LTD），影响小鼠行为，该研究为相关神经机制提供新视角。
在神经科学领域，突触可塑性被视为学习和记忆的分子基础，其中长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）是重要的表现形式，它们依赖于 AMPA 受体（AMPA receptor，AMPA R）的动态转运。然而，内体 pH 的改变会对突触传递和神经发育产生负面影响，目前对于内体 pH 在 AMPA R 转运过程中的具体作用机制尚不清楚。与此同时，质子激活氯离子（proton-activated chloride，PAC）通道虽已被发现，但其在大脑中 AMPA R 转运和突触可塑性方面的功能尚未明确。为了深入探究这些问题，来自约翰霍普金斯大学医学院（Johns Hopkins University School of Medicine）的研究人员展开了一系列研究。
他们的研究成果发表在《Cell Reports》杂志上，为理解神经可塑性的分子机制提供了新的视角。该研究表明，PAC 通道在调节神经元内体 pH 方面发挥着关键作用，进而影响 AMPA R 的内吞作用和 LTD，这一发现对于揭示相关神经疾病的发病机制以及开发潜在治疗策略具有重要意义。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，通过构建基因敲除小鼠模型，如条件性 PAC 基因敲除（cKO）小鼠，来探究 PAC 基因缺失对神经元功能的影响；其次，利用免疫细胞化学和共聚焦显微镜技术，对 PAC 在神经元中的定位进行研究；再者，采用表面生物素化和蛋白质印迹技术，分析 AMPA R 等蛋白的表达和转运情况；此外，还运用电生理记录技术，检测神经元的突触可塑性变化；最后，通过行为学实验，如 Morris 水迷宫实验，评估小鼠的认知和行为功能。
研究结果如下：
- PAC 的定位：研究发现，PAC 主要定位于神经元的早期和循环内体，而不在突触小泡、突触后密度（postsynaptic density，PSD）等部位。研究人员通过转染人源 PAC（hPAC）到原代海马神经元，并用特异性抗体染色，结合共聚焦显微镜观察，发现 PAC 在细胞体、轴突和树突中均有分布，且在树突中与早期内体标记物 EEA1 和循环内体标记物 Syntaxin13 共定位，而与晚期内体蛋白 Rab7、PSD 标记物 Homer1 等无明显共定位 。在小鼠原代海马神经元和人诱导多能干细胞衍生神经元（iPSNs）中也得到了类似的结果，验证了 PAC 的定位特点。
- PAC 对内体 pH 的调节作用：为研究 PAC 对神经元内体 pH 的影响，研究人员通过表达对照短发夹 RNA（shRNA）或 PAC 特异性 shRNA，构建了对照和 PAC 敲低（KD）神经元。利用比率型 pHluorin（RpH）融合蛋白 TfR-RpH 来测量内体 pH，结果显示，PAC KD 神经元的内体 pH 显著低于对照神经元，表明 PAC 能够防止神经元内体过度酸化。进一步研究发现，野生型（WT）hPAC 能够挽救 PAC KD 神经元的内体 pH，而内吞缺陷突变体 Y10A/L13A（YLAA）和通道失活突变体 K319A 则无法挽救，说明内体 pH 的调节依赖于 PAC 通道的正确定位和活性。
- PAC 对 AMPA R 转运的影响：在未刺激的神经元和化学 LTP（cLTP）过程中，PAC KD 对 AMPA R 的侧向扩散和向树突棘的递送没有显著影响。研究人员通过荧光漂白恢复（FRAP）技术和测量 SEP-GluA2（一种标记 AMPA R 亚基 GluA2 的荧光蛋白）在树突棘中的荧光强度，发现 PAC KD 神经元与对照神经元在这些方面没有明显差异。然而，在化学 LTD（cLTD）过程中，PAC KD 神经元的 AMPA R 内吞作用受损。通过表面生物素化实验和免疫细胞化学染色发现，在 cLTD 刺激后，对照神经元的 AMPA R 亚基 GluA2 能够正常内化，而 PAC KD 神经元的 GluA2 内化明显减少，且在刺激后 GluA2 与早期内体标记物 EEA1 的共定位也受到影响，表明 PAC KD 神经元中 AMPA R 从细胞表面到早期内体的初始转运受损。此外，研究人员还开发了一种基于 HaloTag-GluA2 和 pH 敏感的 Halo 染料 AcidifluorORANGE 的活细胞成像 cLTD 检测方法，进一步验证了 PAC 在 AMPA R 内吞和内体动力学中的重要作用，过表达 WT PAC 能够挽救 AMPA R 内吞缺陷，而 YLAA 和 K319A 突变体则不能。
- PAC 基因敲除小鼠的生理和行为学变化：研究人员构建了锥体神经元特异性 PAC 基因敲除小鼠，发现其树突棘密度和基础突触传递正常。通过对海马 CA1 区锥体神经元的形态学分析和电生理记录，测量微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）、诱发的兴奋性突触后电流（EPSCs）等指标，结果显示 PAC cKO 小鼠与野生型小鼠在这些方面没有显著差异，表明 PAC 通道在基础条件下对海马兴奋性突触传递并非必需。然而，PAC cKO 小鼠的海马 LTD 受损，而 LTP 正常。通过测量海马脑片的场兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率和单个神经元的全细胞记录，发现无论是 NMDAR 依赖的 LTD 还是 mGluR 依赖的 LTD，在 PAC cKO 小鼠中均明显受损。在行为学实验中，PAC cKO 小鼠在需要行为灵活性的任务中表现较差，如在 Morris 水迷宫逆转实验中，cKO 小鼠在逆转训练的前 2 天表现明显不如野生型小鼠，在探测实验 2 中，cKO 小鼠在正确目标象限停留的时间也显著减少，而游泳速度在两组之间没有差异，表明 PAC 缺失导致小鼠行为灵活性受损。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，PAC 通道在调节神经元内体 pH 和 LTD 方面具有重要作用，PAC 缺陷会导致内体过度酸化，进而损害 AMPA R 内吞和 LTD，最终影响小鼠的适应性行为。该研究揭示了一种新的调节机制，为理解突触可塑性的分子基础提供了重要依据。此外，研究还发现 LTP 和基础突触传递在 PAC 缺失的情况下不受影响，表明 LTP 和 LTD 在分子机制上存在差异，LTP 可能较少依赖于内吞机制来实现 AMPA R 向 PSD 的早期递送。同时，研究人员也指出了研究存在的局限性，如实验大多在体外过表达 GluA2 的神经元中进行，未来可利用转基因小鼠在体内进行更深入的研究。此外，HaloTag-GluA2 检测方法也存在一定的局限性，如无法观察内体酸化和成熟之前的早期内吞事件，且无法确定酸化囊泡的身份。尽管如此，该研究为神经科学领域的研究开辟了新的方向，未来进一步探究 PAC 在不同神经元类型和生理病理背景下的作用，将有助于深入理解神经可塑性的调控机制，为相关神经疾病的治疗提供潜在的靶点和策略。
