RNA m5C 甲基化修饰：造血干细胞发育调控的关键密码

本文聚焦造血干细胞和祖细胞（HSPCs），发现 RNA m5C 修饰在其发育中意义重大。Ybx1 可识别 m5C 修饰的 mRNA，维持细胞周期相关转录本稳定，确保 HSPCs 扩增。这为深入理解造血发育及优化 HSPCs 扩增提供新视角。

　　

研究背景

造血干细胞和祖细胞（HSPCs）是一类成年组织干细胞，在脊椎动物中负责终身供应血细胞。其起源于主动脉 - 性腺 - 中肾（AGM）区域，经历内皮 - 造血转化（EHT）过程产生。随后，HSPCs 在哺乳动物的胎儿肝脏（FL）或斑马鱼的尾部造血组织（CHT）区域进行扩增、成熟和分化，最终定植于哺乳动物的骨髓（BM）或斑马鱼的肾脏骨髓（KM），维持造血平衡。在发育过程中，HSPCs 的细胞状态和功能特性发生动态转变，伴随着大规模的转录组重编程，但背后的分子机制尚不清楚。

RNA 的化学修饰是转录组调控的重要层面，5 - 甲基胞嘧啶（m⁵C）是一种常见的 RNA 修饰，由甲基转移酶（如 NSUN 家族成员）催化添加，由去甲基酶（如 TET 家族成员）催化去除。一些 RNA 结合蛋白（如 ALYREF、YBX1、YBX2 和 SRSF2）可识别 m⁵C 位点，介导 mRNA 代谢调控，参与多种生物学过程。鉴于 m⁵C 在转录组调控中的重要性，本研究旨在探索其在 HSPC 发育中的潜在作用。

研究结果

1. HSPC 发育过程中 m⁵C 修饰的动态转录组景观：通过对斑马鱼不同发育阶段的 HSPCs 进行 RNA 亚硫酸氢盐测序（RNA - BisSeq）和 RNA 测序（RNA - seq），发现 mRNA m⁵C 位点主要位于编码序列（CDS）区域。与 AGM 来源的 HSPCs 和 KM 定植的 HSPCs 相比，CHT 驻留的 HSPCs 在位点和 mRNA 水平上的全球 m⁵C 甲基化水平显著增加。对 m⁵C 修饰的 mRNA 进行分类和基因本体（GO）分析，发现不同发育阶段的 m⁵C 修饰与 HSPCs 的特定功能相关。例如，AGM 来源的 HSPCs 中高甲基化的 mRNA 与细胞行为相关，CHT 驻留的 HSPCs 中 m⁵C 修饰的 mRNA 富集在细胞周期相关功能，KM 定植的 HSPCs 中特定的高甲基化 mRNA 与造血和刺激反应相关。此外，研究还发现 m⁵C 修饰可能参与调节 mRNA 稳定性，且在 HSPC 发育过程中，RNA 剪接可能不是关键因素。
2. Ybx1 对 HSPC 扩增至关重要：通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测 m⁵C 关键调节因子的 mRNA 表达，发现 Ybx1 在 HSPCs 中表达较高。双荧光原位杂交（dFISH）和 qPCR 进一步证实 Ybx1 在 CHT 区域的 cmyb⁺ HSPCs 和 runx1⁺ HSPCs 中高表达。利用 Ybx1 吗啉代寡核苷酸（MO）敲低 Ybx1 表达，发现 HSPCs 的生成在早期相对不受影响，但从 52 hpf 开始，CHT 中 HSPC 标记物 cmyb 的表达下降，HSPC 数量减少。利用 Ybx1 突变体进一步验证了 Ybx1 缺失导致的 HSPC 缺陷，低剂量 MO 注射可消除母体效应，使表型更明显。此外，野生型 Ybx1（Ybx1^WT）mRNA 和转录活性缺陷的 Ybx1（Ybx1 删除核定位信号 [Ybx1^{del NLS}]）mRNA 可有效恢复 Ybx1 缺失后 HSPCs 的减少，表明缺陷表型源于 Ybx1 的功能丧失，与转录活性无关。
3. Ybx1 以细胞自主方式调节 HSPC 发育：通过移植实验，将来自对照 MO 和 Ybx1 MO 注射胚胎的 runx1:en - GFP⁺ HSPCs 移植到辐照的成年受体中，发现 Ybx1 缺陷胚胎来源的 GFP⁺细胞百分比低于对照组，且多谱系分析显示 Ybx1 缺陷的 HSPCs 祖细胞和髓系谱系重建效率降低，红系谱系重建效率增加，表明 HSPCs 的受损主要源于其内在缺陷。生成野生型和 Ybx1 缺陷胚胎的联体胚胎对，发现 Ybx1 缺陷胚胎作为供体时，野生型受体 CHT 中 runx1⁺细胞数量显著降低，而野生型 HSPCs 在 Ybx1 缺陷受体 CHT 中的数量与在野生型受体中的数量相当，表明 Ybx1 缺陷胚胎的 CHT 微环境可支持正常 HSPC 发育。此外，在 HSPCs 中特异性过表达 Ybx1^WT可有效挽救 Ybx1 缺陷后 HSPC 标记物的表达降低和 HSPC 数量减少，进一步证明 Ybx1 在 HSPCs 中的特定功能。
4. Ybx1 通过识别 m⁵C 调节 HSPC 扩增：生成 Ybx1 突变体 Ybx1^W45F，其在 m⁵C 识别关键位点发生氨基酸替换。拯救实验表明，Ybx1^WT能显著恢复 Ybx1 缺陷胚胎中 cmyb 和 ikaros 的表达，而 Ybx1^W45F不能，表明 HSPC 缺陷与 Ybx1 无法结合 m⁵C 位点有关。用 eltrombopag 处理斑马鱼胚胎，可增加 mRNA m⁵C 水平和 CHT 驻留 HSPCs 数量，表明升高的 RNA m⁵C 水平与 HSPCs 扩增相关。
5. Ybx1 缺失导致 HSPCs 细胞周期缺陷：对 Ybx1 缺陷的 HSPCs 进行 RNA - seq 和 RNA 免疫沉淀测序（RIP - seq），发现 Ybx1 结合峰主要位于 CDS 区域。在 Ybx1 缺陷的 HSPCs 中，598 个 Ybx1 结合靶标中有 198 个转录本下调，其潜在功能与细胞周期、染色质重塑等相关。基因集富集分析（GSEA）显示，Ybx1 缺失导致有丝分裂细胞周期过程和细胞周期相关功能调节下调。筛选出 642 个在 CHT 驻留 HSPCs 中表达的细胞周期相关 mRNA，其中 109 个在 Ybx1 缺陷的 HSPCs 中显著下调，仅 17 个上调。通过实验证实了 Ybx1 结合的细胞周期转录本如 cyclins、mcms 和 mki67 在 Ybx1 缺陷的 CHT 驻留 HSPCs 中下调。PI 染色、EdU 掺入试验和 pHH3 免疫染色表明，Ybx1 缺失导致 HSPCs 在 G₀和 G₁期的百分比增加，在 S 和 G₂/M 期的比例降低，细胞增殖受损。时间推移图像显示，Ybx1 缺陷胚胎的 CHT 血管微环境中的 runx1⁺ HSPCs 几乎不增殖。此外，Ybx1 缺失后，HSPCs 中未观察到明显的细胞凋亡和 DNA 损伤。
6. Ybx1 直接结合并稳定带有 m⁵C 的细胞周期转录本：整合 Ybx1 RIP - seq 和 RNA - BisSeq 数据，发现 m⁵C 修饰的 mRNA 和 Ybx1 结合的 mRNA 有显著重叠，Ybx1 结合峰与 m⁵C 峰在 CDS 区域分布相似且空间接近，表明 m⁵C 修饰的 mRNA 倾向于被 Ybx1 结合。对 Ybx1 缺陷时下调的 m⁵C 修饰的 Ybx1 靶标进行分析，发现富集了细胞周期相关术语和 mRNA。通过实验证实了 Ybx1 与 cyclin d1 和 mcm6 的相互作用，以及 Ybx1 通过识别 m⁵C 修饰结合这些转录本。此外，Ybx1 缺失导致 m⁵C 修饰的细胞周期相关 mRNA 稳定性降低，过表达 cyclin d1 - cdk4 复合物可恢复 HSPCs 的细胞周期进展，减轻 Ybx1 缺陷后的造血缺陷。
7. Ybx1 与 Pabpc1a 协同调节 HSPC 扩增：已有研究表明，Ybx1 调节的 m⁵C 修饰 mRNA 的稳定性依赖于其相互作用伙伴 Pabpc1a。本研究通过共免疫沉淀验证了 FLAG - Pabpc1a 与内源性 Ybx1 的直接相互作用，发现 Pabpc1a 在 runx1⁺ HSPCs 中高表达，且与 Ybx1 共定位。利用 MO 敲低 Pabpc1a 表达，发现与 Ybx1 缺陷类似，Pabpc1a 缺失导致 HSPCs 中 cmyb 和 ikaros 表达降低，细胞周期相关基因 cyclin d1 和 mcm6 表达下降，BrdU⁺cmyb⁺细胞百分比降低，表明 Pabpc1a 与 Ybx1 协同稳定 m⁵C 修饰的细胞周期相关 mRNA，确保 HSPCs 增殖。
8. Ybx1 对小鼠 FL HSPC 扩增是必需的：在小鼠 E14.5 的 FL 中，发现 Ybx1 与 HSPC 标记物 c - Kit 共定位。通过 siRNA 敲低小鼠 E14.5 FL 中 lineage^?Sca - 1⁺c - Kit⁺（LSK）细胞中的 Ybx1 表达，导致 LSK 细胞比例显著降低，集落形成能力受损，关键造血相关基因下调，Ki67⁺ LSK 细胞比例降低，细胞周期相关基因表达下调，Cyclin D1 和 Mcm6 mRNA 表达水平因 mRNA 衰减增强而下降，表明 Ybx1 在脊椎动物 HSPC 发育中的作用具有保守性。

研究讨论

本研究全面揭示了动态 RNA m⁵C 景观对 HSPC 扩增的影响机制。在 HSPC 发育过程中，RNA m⁵C 修饰具有潜在的阶段特异性功能，Ybx1 在扩张的 HSPCs（斑马鱼 CHT 驻留 HSPCs 和小鼠 FL HSPCs）中识别并稳定与细胞周期相关的 m⁵C 修饰的 mRNA，与 Pabpc1a 协同作用。此前对 HSPC 发育的研究主要集中在转录水平的调控，而本研究强调了 RNA m⁵C 修饰在转录后水平精细调节基因表达，从而调控 HSPC 细胞状态转变的分子机制。

目前，虽然已有研究报道 RNA m⁵C 修饰参与胚胎发育、肿瘤发生等过程，但对其在胚胎造血中的作用和具体机制了解有限。本研究揭示了 RNA m⁵C 修饰在调节 mRNA 稳定性方面的重要功能，这对从 AGM 来源的 HSPCs 到 CHT 驻留 HSPCs 的发育过程中的转录组重编程具有重要意义。通过稳定 m⁵C 修饰的细胞周期相关 mRNA，HSPCs 可维持活跃的细胞周期状态，有望应用于体外扩增 HSPCs。此外，研究发现 TET 抑制剂可提高 mRNA m⁵C 水平并促进 HSPCs 扩增，但该抑制剂对 DNA 5 - 甲基胞嘧啶的影响尚待进一步研究。

细胞周期是基本的生物学过程，主要由核心机制组件（如周期蛋白和 CDKs）调控。本研究表明，稳定的 m⁵C 修饰的 mRNA 为细胞周期中蛋白质的及时合成提供了可靠来源，这是细胞周期在转录后水平调控的新层面。然而，Ybx1 介导的 m⁵C 修饰如何同时调节多个细胞周期相关 mRNA 的机制尚不清楚。有研究报道 Ybx1 和 Pabpc 可通过介导液 - 液相分离（LLPS）调节生物学过程，因此推测在 CHT 驻留 HSPCs 中，Ybx1 和 Pabpc1a 可能通过 LLPS 使 m⁵C 修饰的 mRNA（包括细胞周期相关 mRNA）共存于液体样凝聚物中，增强其稳定性，但这一假设需要进一步研究验证。

研究局限

在 HSPC 扩增过程中，m⁵C 修饰的转录本范围广泛，除细胞周期相关 mRNA 外，还包括造血转录因子、MAPK 信号通路相关转录本等，这些转录本可能也对 Ybx1 缺陷胚胎中的 HSPC 缺陷有贡献，未来研究需要更全面地探索这些方面。此外，虽然观察到 TET 抑制剂处理后 RNA m⁵C 甲基化水平增加，但不能完全排除其对 DNA m⁵C 的影响，需要进一步验证和探索其作用机制。

研究展望

本研究为理解造血过程提供了新的视角，揭示了 Ybx1 介导的 m⁵C 修饰在 HSPC 发育中的关键作用。未来研究可进一步深入探究 m⁵C 修饰的其他转录本在 HSPC 发育中的功能，以及 Ybx1 和 Pabpc1a 介导的 LLPS 在造血发育中的作用机制。此外，基于本研究结果，有望开发通过调节 mRNA 修饰来优化 HSPCs 体外扩增的新策略，为再生医学提供理论基础和技术支持。