连续培养中遗传稳定性突破：基于infA互补系统实现柠檬酸酯的千小时稳定生产

本研究针对连续培养中工程菌株遗传不稳定性这一技术瓶颈，通过构建infA互补的质粒成瘾系统，结合磷酸盐限制培养策略，成功实现大肠杆菌连续生产柠檬酸酯(CMA)达1,000小时，生产率达0.32 gCMA gDCW-1 h-1。该研究为可再生原料生物制造平台化学品提供了具有商业化潜力的解决方案。

　　

在可持续化学生产领域，利用微生物将可再生原料转化为平台化学品已成为替代化石资源的重要途径。然而当前主流的补料分批培养工艺因生产效率不足，难以满足低价值化学品的商业化需求。虽然连续培养理论上能显著提升体积生产率，但工程菌株的遗传不稳定性——包括分离不稳定性和结构不稳定性——长期阻碍其工业应用。这种不稳定性会导致非生产性突变株在培养体系中占据优势，最终使生产过程崩溃。英国诺丁汉大学可持续工艺技术研究组的Andrew Yiakoumetti和Charlotte Green等研究人员在《iScience》发表的研究，通过创新性地结合遗传和生理策略，成功解决了这一行业难题。

研究团队选择柠檬酸酯(CMA)作为模式产物，该物质可作为甲基丙烯酸(MAA)的前体，后者是聚甲基丙烯酸甲酯的关键原料，2023年欧洲市场规模达255亿美元。通过构建基于infA(翻译起始因子I编码基因)互补的质粒成瘾系统，并优化启动子强度(J23108启动子)，研究人员开发出能稳定表达CMA合成酶(CimA3.7)的工程菌株。关键技术创新包括：启动子强度筛选、染色体整合比较、infA互补系统构建，以及葡萄糖/磷酸盐限制条件下的稳定性测试。

在菌株构建与筛选中，研究人员系统比较了6种不同强度启动子(J23119-J23112)驱动cimA3.7表达的产效平衡，最终选择J23108启动子构建的生产菌株CBC-5，其摇瓶培养24小时CMA产量达4.86±0.31 g L^-1。为提高质粒稳定性，创新性地将infA基因与氯霉素抗性基因构建为操纵子形式(pCBC-9)，通过染色体infA敲除创建质粒依赖型菌株CBC-9。同时构建了染色体整合菌株CBC-11作为对照。

连续培养实验获得突破性发现：在磷酸盐限制条件下，未稳定化菌株CBC-5可维持324±80.4小时稳定生产(0.35±0.02 g_CMA g_DCW^-1 h^-1)，而infA稳定化菌株CBC-9更将稳定生产期延长至1,000小时(144代)，保持0.32±0.01 g_CMA g_DCW^-1 h^-1的生产率。相比之下，葡萄糖限制培养均出现快速失稳现象。通过质粒测序分析发现，葡萄糖限制条件下主要发生基于微同源序列的缺失突变，导致cimA3.7基因截断或失活。

该研究首次证实infA互补系统在真正连续培养中的长期有效性，相比此前报道的trp1互补(易受交叉喂养影响)和ssb互补(仅测试150小时)系统具有显著优势。研究还揭示磷酸盐限制对维持结构稳定性的关键作用——在相同infA稳定化条件下，磷酸盐限制培养的结构稳定性显著优于葡萄糖限制。虽然染色体整合菌株CBC-11也表现出稳定性，但其生产率仅为质粒系统的27%，凸显质粒成瘾系统的技术优势。

这项研究通过整合遗传工程(infA互补系统)和培养策略(磷酸盐限制)的创新，建立了首个具有世代稳定性的平台化学品连续生产系统。其技术路线无需昂贵诱导剂和抗生素，将非生产性停机时间控制在2.4%以内，为可再生原料生物制造提供了具有商业化潜力的解决方案。该成果不仅为CMA工业化生产铺平道路，其通用性策略还可拓展至其他化学品的连续生物制造，推动整个生物基化学品行业向更高效、更可持续的生产模式转型。