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为解决革兰氏阴性菌抗生素耐药性问题，研究人员开展了对 MacAB-TolC 多药外排泵（MEPs）的研究。结果发现细胞中 MacB 和 TolC 过量，存在适配蛋白穿梭机制，且化学、物理扰动可影响其功能。这为抗菌治疗提供了新方向。
在细菌的世界里，耐药性的 “恶魔” 正不断肆虐，给人类健康带来巨大威胁。尤其是革兰氏阴性菌，它们凭借着一层特殊的外膜，对多种抗生素 “免疫”，使得治疗变得愈发困难。多药外排泵（Multidrug efflux pumps，MEPs）在细菌耐药过程中扮演着关键角色，它不仅能将抗生素排出细胞，还参与毒力因子的输出，帮助细菌在恶劣环境中生存。然而，对于 MacAB-TolC 这种 ABC 超家族的非传统多药外排泵，其功能机制仍存在诸多谜团。比如，组成它的三种蛋白质在细胞内的水平是否符合其组装的化学计量比？底物究竟如何进入这个复杂的 “运输机器”？带着这些疑问，来自康奈尔大学等机构的研究人员开启了探索之旅，相关研究成果发表在《Cell Reports Physical Science》上。
研究人员主要运用了定量单分子单细胞成像技术和单分子追踪技术（Single - molecule tracking，SMT）。通过对活大肠杆菌细胞进行研究，他们在染色体位点用荧光蛋白标记 MacB 和 MacA，以此来量化细胞内蛋白质的拷贝数和追踪蛋白质的动态行为。
单细胞蛋白质定量揭示细胞内 MacB 过量
研究人员标记 MacB 和 MacA 后测量其在单个细胞中的拷贝数，发现细胞中 MacA 与 MacB 的摩尔比远低于其组装化学计量比 6:2，结合 TolC 的丰度，表明 MacA 是 MacAB-TolC 复合物形成的限制因素，细胞中存在大量过量的 MacB。
单分子追踪揭示 MacAB-TolC 的动态相互作用
SMT 显示，MacB 在野生型细胞中有两种扩散状态，准静止状态主要由组装的复合物和聚集的 MacB 二聚体构成，且 MacB 在两种状态间动态转换；MacA 也有两种状态，其准静止状态占主导，两种状态间的转换反映了其与 MacAB-TolC 复合物的动态组装和解离。不同基因缺失菌株的研究进一步证实了各蛋白间的相互作用对其扩散状态的影响。
MacB 和 MacA 在细胞中呈现不同的空间定位
通过全细胞宽场荧光图像和成对距离分布（Pairwise distance distributions，PWDD）分析发现，MacB 呈现颗粒状荧光模式，其 PWDD 在 80nm 处有明显峰值，表明存在聚集现象；MacA 的空间模式较为弥散，不同菌株中 MacA 的 PWDD 峰值面积不同，反映了其在不同状态下的存在形式。
适配蛋白穿梭模型解释 MacAB-TolC 的功能
基于研究结果，研究人员提出适配蛋白穿梭模型。过量的 MacB 从周质捕获底物，底物结合的 MacB 动态聚集在复合物周围，MacA 穿梭与底物结合的 MacB 形成复合物，ATP 结合水解驱动底物外排，复合物解离后 MacA 再穿梭到其他底物结合的 MacB，完成循环。
化学扰动支持 MacB 聚集的功能作用
用 A22 处理细胞，发现 MacB 的聚集明显减少，细胞对红霉素的耐药性降低，这表明 MacB 聚集对 MacA 穿梭和 MacAB-TolC 外排功能很重要，也说明针对不同细胞过程的抗生素可能有协同作用。
物理扰动可改变 MacAB-TolC 的功能
通过挤压加载对细菌细胞施加机械负荷，研究发现随着压力差增加，MacB 和 MacA 的移动分数增加，但在 A22 存在时，情况不同。A22 处理的细胞在挤压加载下，蛋白聚集增加，移动分数变化异常，这表明物理扰动存在两个相互竞争的因素影响跨膜外排复合物的功能。
研究人员揭示了 MacAB-TolC 多药外排泵在大肠杆菌中的独特外排机制，即细胞内蛋白化学计量比与复合物组装化学计量比存在差异，存在适配蛋白穿梭机制，且化学和物理扰动可影响其功能。这一发现为理解革兰氏阴性菌多药外排系统提供了新视角，也为开发新型抗菌治疗方法提供了潜在靶点，有望打破细菌耐药的 “坚冰”，为人类健康带来新的希望。
