单细胞寄生虫作为探究细胞动力学的模式生物
原生生物寄生虫在揭示真核细胞功能，尤其是寄生关系中不同物种细胞间相互作用方面，是极具价值的研究对象。单个真核寄生虫的特性，使得分析一个明确有序的细胞系统成为可能，它包含了更复杂生物体细胞的所有必要组成部分。例如，许多寄生虫拥有特定的、数量为单个或少数的细胞器，而典型的多细胞动物细胞中这些细胞器的数量则处于动态变化中，这就增加了研究特定蛋白质动力学的难度。寄生虫系统相对简单，却能以相似方式执行细胞功能，研究起来也更为便利。
因此，对重要且研究较为深入的原生生物模式生物，如顶复门（Apicomplexa）的疟原虫（Plasmodium ）、弓形虫（Toxoplasma ），或动基体目（Kinetoplastida）的锥虫（Trypanosoma ）、利什曼原虫（Leishmania ）等进行亚细胞动力学分析，具有重要意义。亚细胞动力学对细胞动力学，即单细胞运动性有着重要影响，这本身也是一个引人入胜的细胞生物学研究课题。原生生物是阐明高等生物各种细胞运动机制的理想模型，尽管细胞运动给量化亚细胞过程带来了巨大挑战。
记录活细胞中的亚细胞动力学
寄生虫为了在宿主环境中生存和繁殖，必须不断地在各种环境中移动。即使在附着或被困住的情况下，大多数细胞的运动装置也依然保持活跃状态，这给细胞内过程的分析带来了困难。目前主要有两种解决办法，一是在不阻碍细胞内过程的前提下固定活细胞，二是采用高速技术在快速移动的细胞中捕捉亚细胞机制。
细胞内运动最常见的机制之一，是由驱动蛋白（dynein）和动力蛋白（kinesin）驱动的沿微管的运输。布氏锥虫（Trypanosoma brucei）在揭示鞭毛内运输（IFT）的特殊形式方面发挥了重要作用。在研究中，利用前循环培养形式的布氏锥虫，其单个鞭毛能轻易附着在玻璃表面的特性，通过共聚焦荧光显微镜以 10 赫兹（Hz）的速度，记录了沿固定鞭毛明确轴丝结构的双向 IFT 列车的高分辨率动力学。由于运动局限于轴丝，运动蛋白实际上呈现一维运动，这大大简化了后续的分析过程。
这种固定鞭毛的方法也被应用于墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana ）的研究中。研究人员对比了固定鞭毛和自由摆动鞭毛中 IFT 的差异，发现固定鞭毛中的 IFT 速度更慢，且更容易停滞。这表明，为了捕捉不受阻碍的体内动力学，需要使用帧率为 100 - 200Hz 的高速显微镜。这些对比也指出了在分析人为降低维度的系统时可能存在的问题。
然而，很少有寄生虫能通过简单附着实现固定，因此，能牢固固定寄生虫并限制其运动的方法更为可取。布氏锥虫曾被固定在基于聚乙二醇（PEG）的水凝胶中，用于测量细胞膜表面蛋白的扩散速率。通过 100Hz 的单分子荧光显微镜，研究人员以纳米分辨率对扩散系数约为 1μm2 s?1的扩散过程进行了高分辨率分析。这种固定方法的优势在于，细胞被牢固地嵌入纳米级聚合物网格中，且在约 1 小时内不会受到损害，同时也为细胞内动力学的 3D 分析提供了可能。
对于运动性较低的病原体，如细胞内寄生虫，在其自然体内状态下进行高速显微镜观察，可能足以捕捉细胞内动力学，尽管目前的分析大多为二维（2D）。顶复门寄生虫利用 F - 肌动蛋白（F - actin）网络和非常规肌球蛋白实现其特有的滑行运动（速度可达 10μm2 s?1 ），并借此侵入宿主细胞。疟原虫子孢子、动合子以及弓形虫速殖子，已被用于研究入侵过程中的细胞内动力学。
在弓形虫的入侵或出芽过程中，囊泡和细胞器的运动至关重要，研究人员通过旋转盘共聚焦显微镜和宽场荧光显微镜对其进行了追踪。在宿主细胞相对稳定的环境中，2Hz 的记录速度足以清晰观察到参与这些机械过程的结构在细胞内的极化运动。疟原虫还被用于建立活细胞荧光共振能量转移（FRET）和荧光寿命成像（FLIM） - FRET 成像技术，以展示参与操纵宿主红细胞的复合物的运输情况。
对原生动物寄生虫的研究，有助于同时分析宿主细胞动力学和寄生虫入侵宿主过程中的行为。特别是对被顶复门寄生虫感染的细胞的细胞内动力学分析，意义重大。活细胞分析能够测量宿主细胞在感染后产生的关键动力学变化，这些变化对寄生虫入侵的成败起着决定性作用。例如，疟原虫子孢子在肝脏中与含虫空泡相互作用的过程，以及疟原虫感染红细胞后，寄生虫分泌蛋白对宿主细胞膜的影响（通过 FRET 分析得以揭示）。疟原虫动合子穿越蚊子中肠上皮细胞时引发的一系列反应，也为研究寄生虫突破屏障的过程提供了线索。此外，通过光学代谢成像结合 FLIM 技术，还能监测弓形虫感染后宿主细胞代谢的变化。
克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的非运动性无鞭毛体阶段是一个特殊例子，它表明高分辨率活细胞成像在分析感染过程中细胞内动力学的重要性。研究发现，克氏锥虫在哺乳动物宿主细胞内增殖时，其无鞭毛体阶段保留了一个此前未被识别的、持续搏动的鞭毛。该鞭毛的动力学与宿主线粒体的动力学密切相关，二者之间存在独特的相互作用，这种相互作用可能对宿主细胞质产生多种影响。
细胞运动的亚细胞动力学
为了阐明原生生物运动的机制，需要对处于游动、爬行、滑行、附着或入侵状态的细胞进行亚细胞动力学分析。这就要求研究引起细胞主动运动的细胞骨架亚结构，比如顶复门寄生虫和变形虫中的肌动蛋白 - 肌球蛋白系统，或者鞭毛虫的轴丝弯曲结构。
通过对溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）中肌动蛋白的活细胞成像，研究人员以秒为时间分辨率，研究了阿米巴样运动和依赖肌动蛋白的结构的细胞内动力学。相关研究还包括对肌动蛋白结合蛋白的蛋白质组学分析以及磷酸化研究，以揭示使这些寄生虫能够侵入组织、杀伤并吞噬人类宿主细胞的机械生物学机制。
疟原虫和弓形虫的入侵过程以及其中涉及的肌动蛋白动力学，也得到了深入研究。研究揭示了 F - 肌动蛋白环、聚集体和网络产生力的机制，这些结构使得寄生虫能够推动和拉动细胞，尤其是细胞核，穿越宿主细胞膜。在入侵前，顶复门寄生虫在皮肤组织中的特异性滑行运动，是由肌动蛋白流引起的，同时也存在不依赖肌动蛋白、涉及原肌球调节蛋白的过程。通过活细胞成像，还观察到弓形虫入侵后通过扭转诱导细胞膜分裂，以及疟原虫在蚊子体内发育过程中的小配子发生等有趣且特殊的步骤。
贾第虫（Giardia ）滋养体有一种独特的附着于宿主细胞的方式，它利用一种明显的微管细胞器 —— 腹盘，附着在十二指肠微绒毛上。观察发现，腹盘的收缩是这些肠道寄生虫抓取宿主上皮细胞的关键机制。
在动基体目寄生虫中，非洲锥虫的不同物种和阶段的鞭毛摆动产生推进所需的行波，这一过程已通过高达 500Hz 的高速实时成像进行了详细分析。研究人员根据二维数据绘制 3D 运动图，以评估这些寄生虫复杂的细胞形状变化和波形形成。虽然对旋转运动的完整表征需要其他类型的显微镜，但对锥虫弹性行为的精确动态分析，在亚细胞分辨率下揭示了细胞的运动行为，以及其对环境因素的适应性和对特定宿主生态位的适应机制。
3D 亚细胞动力学
目前，大多数相关分析是通过传统的宽场或共聚焦显微镜进行的，本质上记录的数据是二维的。为了全面理解寄生虫的运动机制和其他行为，生成三维（3D）数据至关重要。特别是运动性鞭毛虫（如动基体目寄生虫）会展现出复杂而快速的 3D 运动，仅通过分析二维数据难以充分推断这些运动，即使采集速度足够快也不行。这一情况适用于从分子层面到宏观层面的任何动态过程。为了实现足够的 3D 时间分辨率并详细分析亚细胞动力学，需要使用不同类型的显微镜。
以溶组织内阿米巴在动态肠道环境中的组织入侵研究为例，这一过程中寄生虫的运动与上皮组织运动相互叠加，通过精心设计的分析流程，成功地解析了这些动力学。研究人员量化了寄生虫对组织施加的机械应力，为深入了解寄生虫与宿主在自然条件下相互作用的机械生物学机制提供了依据。
在疟原虫入侵蚊子中肠组织的过程中，研究人员对其行为进行了 3D 成像，同时观察到宿主细胞肌动蛋白的重组和寄生虫酶活性的变化，并直接追踪了不同条件下动合子内化的能力。通过光片显微镜，研究获得了更高分辨率的信息，可视化了疟原虫入侵红细胞的过程，阐明了膜重塑和含虫空泡形成的动力学，同时以亚细胞精度测量了同步发生的钙通量。此外，一种结合 2D 和 3D 活细胞显微镜的成像流程，被用于可视化疟原虫在蚊子中肠内发生的快速而复杂的小配子发生过程。对弓形虫入侵宿主细胞的过程进行 3D 成像，揭示了一种独特的扭转运动，这种运动有助于含虫空泡与宿主细胞膜分离。
在无法直接进行 3D 活细胞成像的情况下，多模态成像方法能够提供对 3D 过程的高分辨率概述。在顶复门的分歧巴贝斯虫（Babesia divergens ）研究中，相关 X 射线断层扫描和 3D 荧光显微镜与活细胞成像相结合，解析了其无性生命周期的各个阶段。这种方法结合了两种技术的优势，为寄生虫发育过程提供了全面的视角。
这些细胞内寄生虫的运动和过程通常需要几分钟到几小时才能完成，相对较慢，因此可以使用成像速率通常在 1Hz 或更低的共聚焦系统进行 3D 显微镜观察。相比之下，像布氏锥虫和墨西哥利什曼原虫这样的鞭毛寄生虫，需要更快的成像速率来捕捉其快速的鞭毛摆动，通常为 20Hz。通过 200Hz 的高速多焦平面荧光显微镜，实现了对鞭毛摆动的 3D 重建，这使得在翻滚运动中观察鞭毛的间歇形状成为可能，并为了解鞭毛在寄生虫重新定向中的作用提供了线索。虽然这种方法具有较高的时间分辨率，但在轴向（Z）分辨率方面存在局限性。
数字全息显微镜（DHM）能够实现快速的 3D 成像，且具有近乎无限的 Z 分辨率。DHM 利用基于干涉的照明方式，将图像信息编码在干涉图案的相位和幅度中。最初，DHM 被用于测量布氏锥虫的 3D 游动运动，但早期应用受到帧率和分辨率的限制。随着相机技术的进步，现在 DHM 可以使用明亮的照明实现极高的成像速率，达到甚至超过 1kHz。
由于 DHM 捕捉的是样品的拓扑信息，需要通过计算重建才能生成可解释的图像。其空间分辨率由相机决定，而 Z 分辨率主要取决于重建参数，在某些系统中能够达到个位数纳米的精度。尽管计算和存储需求较大，但 DHM 现在能够以非常高的分辨率进行运动分析，为研究鞭毛的弯曲行为、刚度和其他生物物理参数提供了有力手段，这在精子研究中已得到验证。类似的分析也在利什曼原虫中开展，揭示了前循环和后循环细胞之间不同的游动行为。DHM 还被用于对带有鞭毛的布氏锥虫细胞体进行详细分析。
与 DHM 类似，光学衍射断层扫描（ODT）是一种无标记成像方法，它利用成像光束和参考光束之间的干涉。通过从不同角度照射细胞，ODT 可以在几秒钟内重建细胞折射率的 3D 图谱，从而观察细胞内随时间的变化。ODT 已被用于区分巴贝斯虫和疟原虫感染的红细胞，因为这两种寄生虫对宿主细胞会产生不同的影响。由于折射率是细胞成分的间接测量指标，ODT 还被用于追踪疟原虫感染红细胞中 3D 胆固醇的分布。为了增强对比度和特异性，可以使用金纳米颗粒作为标记，这有可能用于追踪寄生虫内的内体 - 溶酶体动力学，并且 ODT 可以与布里渊显微镜结合，以提取细胞区室的刚度信息，但这会在很大程度上限制空间和时间分辨率。
最近，单分子成像技术首次被用于研究布氏锥虫表面的 3D 动力学。研究人员以低于 100nm 的空间分辨率、25Hz 的速率追踪荧光标记的变异表面糖蛋白（VSG），这种时空分辨率和维度在寄生虫研究中此前尚未探索过。该研究揭示了寄生虫表面一种此前未被发现的扩散亚群，并确定鞭毛为扩散屏障。这些发现为理解寄生虫表面动力学如何促进其有效逃避免疫系统提供了新的视角。
当前可用的成像和标记技术
显微镜系统和标记策略的不断进步，持续推动着可视化技术的发展，使研究能够更加详细和动态地进行。这不仅需要合适的设备，还需要在成像设置方面做出谨慎决策。由于样品的光子预算有限，研究人员常常需要在某些成像方面进行权衡，比如优先考虑空间分辨率，而牺牲时间分辨率，这种现象被称为 “挫折金字塔”，它表明无法同时最大化所有图像属性。
在活细胞中可视化动态过程，进一步限制了这些优先选择。为了将细胞毒性降至最低，需要使用低激光强度，同时成像速率又要足够高，以避免移动样品出现模糊。成像条件的选择在很大程度上还取决于可用的显微镜系统，而使用高灵敏度或基于事件的相机，有助于突破这些限制。艾里扫描共聚焦显微镜能够提供更快的成像速率，并且越来越普及。然而，对于高分辨率成像，通常需要使用采用单分子定位显微镜（SMLM）方法和单粒子追踪的专业显微镜。
尽管有众多超分辨率显微镜方法可供选择，但并非所有方法都适用于记录活细胞的 3D 动力学。例如，直接随机光学重建显微镜（dSTORM）虽已用于活细胞成像，但该方法对光开关荧光团、标记和成像环境（包括淬灭剂）有严格要求。此外，计算成本高昂的重建过程可能会阻碍高速 3D 成像。目前最先进的方法包括活细胞受激发射损耗显微镜（STED）和最小荧光光子通量显微镜（MINFLUX），它们能够在毫秒时间尺度上实现纳米级精确的定位。具有高时间分辨率的成像方法，使得超分辨率光学涨落成像（SOFI）和超分辨率径向涨落（SRRF）分析得以应用，通过荧光染料的波动发射来增强重建结构的空间分辨率，从而放大成像动态过程所获得的信息。
商业显微镜设备价格昂贵，但也有构建强大的自制单分子定位显微镜的方案。根据所需的轴向范围，可以调整各种模块以满足特定的研究需求。
在随时间追踪分子时，标记策略的选择与显微镜系统同样关键。虽然常用的绿色荧光蛋白（GFP）在许多应用中具有优势，但与合成染料（如 ATTO、Alexa 或 Janelia Fluor）相比，其光物理性质较差，且尺寸明显更大。在选择染料时，研究人员必须考虑其生物相容性、膜通透性以及可能限制其在特定场景使用的功能化特性。
在测量蛋白质动力学时，需要注意所用荧光团可能带有电荷，这可能会诱导与膜的相互作用，从而影响观察到的动力学。引入用于结合人工染料的标签会增加标记蛋白质的大小，可能会损害其功能。标签的大小各不相同，从相对较大的类似 GFP 的 Halo - tag 到较小的 SNAP/CLIP - tag。最近的研究进展改进了 Halo - tag 系统，实现了荧光染料的非共价结合以延长成像时间、开发了用于相互作用诱导结合的分裂 Halo - tag，以及更快结合染料的新衍生物。
软件、算法和神经网络的不断改进助力数据分析
获取高质量的亚细胞动态数据是后续分析的关键第一步。然而，在追求时空分辨率突破和面对高分辨率活细胞成像挑战的过程中，研究人员可能无法立即全面了解高质量数据的要求。在几次实验中就可能获取数 TB 的图像数据，这给分析带来了巨大挑战。虽然廉价存储空间的出现使存储不再是大问题，但真正的挑战在于高效的计算分析。低效的代码可能会使处理时间从几分钟延长到数小时。在没有（生物）信息学家协助的情况下，实验人员往往难以开发出可靠的分析流程。因此，科学成像领域致力于为非专家提供更易用的数据分析工具，推动数据分析的普及。
在衍射极限显微镜中，去卷积是一种成熟的方法，用于减少噪声和细化图像细节。商业软件（如 Huygens （SVI））提供了长期以来最先进的实现方案，而开源替代方案则提供了免费的解决方案，并且通常使用 Python 或 Julia 实现，具有自动化的潜力。图像增强后，通常需要进行分割以识别要追踪的对象。几十年来，基于强度的阈值化方法一直是常用手段，但如今已被基于深度学习的方法取代。深度学习方法能够识别并利用图像的结构特征，将对象与图像背景分离。由于不同显微镜方法产生的图像模态差异很大，通常需要专门的方法来解释图像中编码的信息，比如针对 DHM 图像的深度学习方法。
对于 2D 和体积图像数据，有方便的一体化解决方案，如 Imaris （Oxford Instruments）或 uTrack3D，它们能够引导用户完成图像处理<
