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这篇综述聚焦单细胞寄生虫亚细胞动力学研究。文中探讨了利用多种技术记录其亚细胞动态过程，包括在 2D 和 3D 层面的研究，还介绍了成像、标记技术及数据分析方法。这些研究有助于深入理解寄生虫行为，为相关疾病防治提供新视角。
单细胞寄生虫：研究细胞动力学的理想模型
原生生物寄生虫是研究真核细胞功能以及寄生关系中不同物种细胞间相互作用的有趣生物。其单细胞特性使细胞系统分析更明确有序，许多寄生虫特定细胞器数量少，便于研究特定蛋白质动力学。像疟原虫（Plasmodium）、弓形虫（Toxoplasma）、锥虫（Trypanosoma）和利什曼原虫（Leishmania）等，都是重要的研究模型。它们的亚细胞动力学不仅关乎细胞内物质运输、代谢等过程，还决定了单细胞的运动性。例如，细胞表面分子的定向或扩散运动、膜通道的移动性、受体的分布和移动等动态过程，在寄生虫的生存、繁殖和感染过程中都起着关键作用。
记录活细胞中的亚细胞动力学
寄生虫在宿主体内不断运动，这给细胞内过程的分析带来困难。目前有两种主要解决方法：一是在不阻碍细胞内过程的情况下固定活细胞；二是采用高速技术捕捉快速移动的细胞内机制。
在固定细胞方面，锥虫（Trypanosoma brucei）的研究提供了很好的范例。其前循环培养形式的单个鞭毛易附着在玻璃表面，利用这一特性，通过共聚焦荧光显微镜以 10 赫兹（Hz）的速度记录鞭毛上双向的鞭毛内运输（IFT），IFT 速度约为几 μm/s 。利什曼原虫（Leishmania mexicana）也采用了类似的固定鞭毛方法，但研究发现固定后的 IFT 速度变慢且更易停滞，这表明需要 100 - 200Hz 的高速显微镜才能捕捉其体内真实动态。此外，锥虫（T. brucei）还被固定在聚乙二醇（PEG）基水凝胶中，用于测量细胞膜表面蛋白的扩散速率，该方法可实现纳米级分辨率的分析，且能进行 3D 分析。
对于运动性较低的细胞内寄生虫，如疟原虫和弓形虫，高速显微镜在其自然体内状态下观察细胞内动态是可行的。在宿主细胞相对稳定的环境中，利用旋转盘共聚焦和宽场荧光显微镜，以 2Hz 的记录速度就可清晰观察到弓形虫在入侵或出芽过程中囊泡和细胞器的运动。疟原虫则被用于建立活细胞荧光共振能量转移（FRET）和荧光寿命成像（FLIM） - FRET 成像，以研究其对宿主红细胞的影响。研究还发现，疟原虫感染会引起宿主细胞一系列变化，如疟原虫感染红细胞后，FRET 分析显示寄生虫分泌蛋白对宿主细胞膜有影响；疟原虫子孢子在肝脏中，宿主细胞的溶酶体会与寄生泡相互作用；疟原虫动合子穿越蚊子中肠上皮细胞时会引发一系列反应，这些都通过相关成像技术得以观察和研究。
细胞运动的亚细胞动力学
为了阐明原生生物运动的机制，需要分析其在游泳、爬行、滑行、附着或入侵过程中的亚细胞动力学。
在阿米巴原虫（Entamoeba histolytica）中，通过对肌动蛋白的活细胞成像研究其变形运动和肌动蛋白依赖结构的细胞内动力学，时间分辨率可达 1 秒，还进行了蛋白质组学研究以揭示其进入组织、杀伤和吞噬宿主细胞的机制。疟原虫和弓形虫入侵宿主细胞过程中，F - 肌动蛋白环、池和网络产生的力推动寄生虫穿过宿主细胞膜，相关研究展示了这一过程中肌动蛋白的动态变化。此外，弓形虫入侵后还会发生扭转以诱导细胞膜裂变，疟原虫在蚊子体内发育过程中的小配子发生等过程也通过活细胞成像进行了分析。
贾第虫（Giardia）滋养体通过微管细胞器腹盘附着在十二指肠微绒毛上，腹盘的收缩使其能够牢固附着在宿主上皮细胞上。非洲锥虫的摆动鞭毛弯曲产生推进所需的行波，通过高达 500Hz 的高速实时成像绘制 3D kymographs，可详细分析其细胞形状变化和波形成过程，这有助于了解锥虫的运动行为以及它们对不同环境的适应性。
3D 亚细胞动力学
目前大多数分析是在 2D 条件下进行的，但要全面理解寄生虫的运动和其他行为机制，3D 数据不可或缺。
在疟原虫入侵蚊子中肠组织的研究中，通过 3D 成像可以同时观察到宿主细胞肌动蛋白的重组、寄生虫酶活性的变化以及动合子内化能力的差异。光片显微镜的应用提高了分辨率，能够清晰显示疟原虫入侵红细胞的过程，包括膜重塑、寄生泡形成以及钙通量的变化。此外，通过建立 2D 和 3D 活细胞显微镜切换的成像管道，对疟原虫小配子发生这一复杂过程进行了可视化研究。弓形虫入侵宿主细胞的 3D 成像揭示了其独特的扭转运动，这种运动有助于寄生泡与宿主细胞膜分离。
数字全息显微镜（DHM）能够实现快速、3D 成像，且具有近乎无限的 z 轴分辨率。它利用干涉原理编码图像信息，最初用于测量锥虫（T. brucei）的 3D 游泳运动。随着相机技术的发展，其成像速度可达 1kHz 以上。虽然 DHM 在计算和存储方面要求较高，但能够提供鞭毛弯曲行为、刚度等生物物理参数的高分辨率信息，已在精子研究中得到应用，也用于分析利什曼原虫不同细胞阶段的游泳行为。
光学衍射断层扫描（ODT）是一种无标记成像方法，通过从不同角度照射细胞，可在几秒内重建细胞的折射率 3D 图，用于观察细胞内随时间的变化。ODT 可区分巴贝斯虫（Babesia）和疟原虫对红细胞的感染，还可用于追踪疟原虫感染红细胞内的胆固醇分布。结合金纳米颗粒标记和布里渊显微镜技术，可进一步研究细胞内的动态过程，但会在一定程度上降低空间和时间分辨率。
最近，单分子成像技术首次用于研究锥虫（T. brucei）表面的 3D 动力学。以 25Hz 的频率追踪荧光标记的变异表面糖蛋白（VSGs），实现了亚 100nm 的空间分辨率，发现了寄生虫表面以前未被发现的扩散亚群，并确定鞭毛为扩散屏障，这为理解寄生虫的免疫逃避机制提供了新线索。
当前可用的成像和标记技术
显微镜系统和标记策略的不断进步推动了可视化研究的发展，但也面临一些挑战。由于样本的光子预算有限，研究人员往往需要在空间分辨率、时间分辨率等成像方面进行权衡，这被称为 “挫折金字塔”。
在成像方面，活细胞动态过程的可视化对成像条件要求更高。既要尽量降低细胞毒性，采用低激光强度，又要保证成像速率足够高以避免运动样本模糊。高灵敏度或事件驱动相机的使用有助于突破这些限制。艾里扫描共聚焦显微镜成像速度较快，应用越来越广泛。而高分辨率成像通常需要使用单分子定位显微镜（SMLM）方法和单粒子追踪技术，如直接随机光学重建显微镜（dSTORM）、受激发射损耗显微镜（STED）和最小荧光光子通量显微镜（MINFLUX）等。其中，STED 和 MINFLUX 能够在毫秒级时间尺度上实现纳米级精确定位，结合超分辨率光学涨落成象（SOFI）和超分辨率径向涨落（SRRF）分析，可进一步提高重建结构的空间分辨率。
在标记策略方面，选择合适的标记物至关重要。常用的绿色荧光蛋白（GFP）在某些方面不如合成染料，如 ATTO、Alexa 或 Janelia Fluor，后者在光物理性质上更具优势，且尺寸更小。在选择染料时，需要考虑其生物相容性、膜通透性以及功能化等因素。此外，标记蛋白时，荧光团的电荷可能会与膜相互作用，影响观察到的动力学，标记标签的大小也可能会影响蛋白质的功能。近年来，Halo - tag 系统不断改进，出现了非共价结合荧光染料、分裂 Halo - tag 和新衍生物等，以满足不同的成像需求。
软件、算法和神经网络的持续改进助力数据分析
获取高质量的亚细胞动态数据是后续分析的关键，但高分辨率活细胞成像带来的大量数据给分析带来了挑战。目前存储问题已因廉价存储空间的出现而得到缓解，但高效的计算分析仍是难题。
在衍射极限显微镜中，反卷积是一种成熟的降噪和细化图像细节的方法。商业软件如 Huygens（SVI）提供了先进的实现方式，而开源软件如基于 Python 或 Julia 的工具则具有自动化潜力。图像增强后，通常需要进行分割以识别要追踪的对象。传统的基于强度的阈值法已逐渐被深度学习方法取代，深度学习方法能够利用图像的结构特征将对象与背景分离。由于不同显微镜方法的图像模态差异较大，往往需要专门的方法来解读图像中的编码信息，如针对数字全息显微镜（DHM）的深度学习方法。
对于 2D 和体积图像数据，有一些一体化解决方案，如 Imaris（Oxford Instruments）和 uTrack3D，它们具有图形用户界面（GUI），可引导用户完成图像处理、分割和追踪的各个步骤，但通常局限于特定的图像模态，灵活性较差。
超分辨率技术通常需要开发定制的分析管道。由于信号已经在空间上分离，反卷积不再必要，但需要算法对单个发射体进行定位以实现纳米级精度。这可以通过基于 GUI 的工具来完成，这些工具利用点扩散函数的信息来确定发射体的位置。然而，超分辨率数据的一体化解决方案较少，定位结果通常需要通过追踪算法进行关联，这增加了工作流程的复杂性。在选择追踪算法参数时，通常需要提供平均速度值，这可能会引入偏差。最近提出的一种追踪方法考虑了整个图像信息，有望解决这一问题，但目前仅适用于 2D，且计算成本较高。
追踪数据的分析也面临挑战，传统的均方位移分析方法常因短而嘈杂的轨迹而失效。需要采用稳健的方法，如空间或时间分箱。新开发的软件 ThirdPeak 可用于 2D 和 3D 生物轨迹数据的可视化和分析，已应用于锥虫（T. brucei）表面扩散数据的研究。
此外，开源软件 ImageJ 及其丰富的插件生态系统是生物成像分析的核心，Python-based napari hub 也在开发中，用于处理大型多维图像数据。深度学习方法逐渐融入这些灵活的系统，商业成像软件也开始整合人工智能，主要用于图像恢复和分割任务。神经网络（NNs）在图像处理的多个领域得到应用，能够进行分类、标记、预测和追踪等任务。在处理大量数据的场景中，如组学研究或粒子行为分类，神经网络方法表现出优势，但也存在一些问题，如模型训练需要大量数据和计算资源，结果可能受到初始选择的超参数影响，图像中的一些小差异可能会显著影响结果，且模型的可解释性较差。为了解决这些问题，需要在高质量的基准数据集上进行测试，并确保训练数据集的平衡分布。同时，基于 Docker 容器的工具开发正在推动先进生物成像分析的普及，通过虚拟化代码和再现计算环境，促进社区贡献和创新。
结论
对寄生虫行为的理解很大程度上依赖于对其在自然或受控环境中动力学的研究。尽管许多研究在 2D 条件下进行，但从 3D 角度分析结果更为准确。高分辨率成像方法的进步使获取 3D 数据成为可能，生物成像软件的不断改进减少了科学家的操作时间，能够处理更多数据。基于神经网络的强大解决方案正在不断发展，有助于揭示和理解以前未被发现的寄生虫过程。未来研究仍面临一些重要问题，如寄生虫细胞信号传导和信号整合在单分子水平上的机制、如何利用动态信息生成更好的模拟模型、能否结合多种技术在自然宿主环境中观察移动寄生虫的亚细胞动力学以及寄生虫行为在 3D 环境中的变化等，这些问题的解决将进一步推动寄生虫学研究的发展。
