化学修饰对异源双链寡核苷酸外显子跳跃活性的影响机制及治疗潜力研究

本研究针对Duchenne肌营养不良症(DMD)等遗传病的治疗难题，创新性地探讨了锁核酸(LNA)修饰的剪接转换寡核苷酸(SSO)与互补链形成的异源双链寡核苷酸(HDO)技术。通过系统优化互补链的化学修饰（如DNA/RNA骨架、硫代磷酸酯(PS)连接）、长度及稳定性，研究人员发现HDO技术显著提升LNA-SSO的核内递送效率和外显子跳跃活性。体内实验证实，经肌肉注射的HDO在mdx小鼠模型中使抗肌萎缩蛋白表达提升20%以上，为罕见病精准治疗提供了新策略。该成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》，为核酸药物的递送系统设计提供了重要理论依据。

　　

基因治疗领域面临的关键挑战是如何高效递送治疗性核酸分子至靶细胞。Duchenne肌营养不良症(DMD)等由基因突变引发的疾病，常需通过外显子跳跃技术修复异常剪接。尽管剪接转换寡核苷酸(SSO)能调控pre-mRNA剪接，但其细胞摄取效率低、核定位不足等问题严重制约疗效。锁核酸(LNA)修饰虽可增强SSO稳定性，但递送障碍仍未突破。

大阪大学与东京医科齿科大学联合团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表的研究中，创新性地将异源双链寡核苷酸(HDO)技术应用于LNA-SSO系统。该技术通过SSO与互补链杂交形成双链结构，利用Lipofectamine RNAiMAX递送，显著提升核内积累。研究人员设计了三类互补链：常规DNA/RNA、含2'-OMe RNA的Wing链及硫代磷酸酯(PS)修饰链，通过熔解温度(T_m)测定和稳定细胞系报告实验，发现9-mer RNA互补链（含末端PS修饰）使外显子跳跃活性提升9倍。时间分辨显微成像揭示，互补链的核内降解速率与活性呈正相关——快速降解的R5设计组（半衰期<24小时）活性优于持久滞留的R4组。在mdx小鼠模型中，肌肉注射HDO使抗肌萎缩蛋白表达量超越单链SSO组2倍，而全身给药时需结合α-生育酚(Toc)修饰才能增强疗效。

关键技术包括：1）采用稳定转染DMD迷你基因的HEK293细胞系评估外显子58跳跃效率；2）UV熔解曲线分析双链稳定性；3）荧光标记（6-FAM/Alexa 647）实时追踪细胞核内分布；4）mdx小鼠肌肉组织RT-PCR和免疫印迹定量疗效。

研究结果部分：
LNA-based HDSSOs的体外评估
通过靶向DMD基因外显子58的SSO（含6个LNA修饰）与不同互补链（DNA/RNA/Wing）形成HDO，发现RNA互补链的跳跃活性比DNA链高1.35倍，Tm值差异提示RNA-DNA杂交体更易解离。

互补链的结构-活性关系
9-mer DNA链活性优于21-mer（p<0.05），而RNA链长度无显著差异；全PS修饰会抑制活性，但5'/3'末端PS的R5设计保留高效性；鸟苷换为肌苷（G>I）的D7组使DNA链活性提升10倍。

细胞内行为可视化
双标记实验显示，SSO与互补链30分钟内共定位至细胞核，但R5组互补链24小时内被降解，而SSO持续滞留。核内滞留过久的R4组（全PS修饰）活性最低。

体内活性验证
局部注射时，HDO使mdx小鼠外显子23跳跃率达20%（单链SSO仅10%），免疫组化证实抗肌萎缩蛋白显著恢复；全身给药需Toc修饰互补链才能增强疗效。

结论指出，HDO技术通过优化互补链设计（如RNA骨架、部分PS修饰、G>I替换）调控核内滞留时间，实现SSO的高效释放。该研究不仅为DMD提供新治疗策略，更建立了核酸药物递送系统的通用优化框架——互补链既可增强递送效率，又能作为功能分子（如Toc）的载体而不影响SSO活性。未来需进一步探索HDO的脱靶效应及全身给药方案的优化。