Nedd4 介导 RORγt 的 K27 连接泛素化：调控 Th17 细胞及自身免疫疾病的新机制

中南大学湘雅医院等机构的研究人员为探究 Nedd4 在 Th17 介导的自身免疫中的作用，开展相关研究。结果表明 Nedd4 通过 K27 连接的多聚泛素化修饰 RORγt，增强其活性，调控 Th17 细胞分化和自身免疫疾病发展，这为治疗相关疾病提供新方向。

　　在人体的免疫系统中，有一种名为辅助性 T 细胞 17（Th17）的细胞，它就像一把双刃剑。在对抗真菌和细菌病原体时，Th17 细胞能发挥重要作用，帮助身体抵御外敌入侵。但在一些情况下，它却会 “调转矛头”，攻击自身组织，引发自身免疫疾病，比如多发性硬化症（MS） 。在 Th17 细胞的分化过程中，有一个关键的转录因子 —— 维甲酸相关孤儿受体 γt（RORγt），它就像一个 “指挥官”，控制着 Th17 细胞的分化进程。然而，T 细胞受体（TCR）信号在 Th17 细胞分化过程中如何调节 RORγt 的激活，一直是个未解之谜。与此同时，一种名为 Nedd4 的 HECT 型 E3 泛素连接酶，虽然此前已知它对 T 细胞反应有正向调节作用，但它在 Th 细胞分化和自身免疫中的具体角色，同样不为人知。这些未知就像一团团迷雾，笼罩在科研人员心头，激发着他们探索的欲望，也促使他们开展了这项研究。

中南大学湘雅医院、美国爱荷华大学等机构的研究人员，针对这些未知问题展开了深入研究。研究发现，Nedd4 是调控 RORγt 的关键 E3 泛素连接酶。在 T 细胞中，Nedd4 能够结合到 RORγt 配体结合域的 PPLY 基序上，并在 K112 位点对 RORγt 进行 K27 连接的多聚泛素化修饰，进而增强 RORγt 的活性。这一发现揭示了 Nedd4 在 Th17 细胞分化过程中的重要作用，也为治疗 Th17 介导的自身免疫疾病，如多发性硬化症，提供了潜在的治疗靶点和新的治疗思路。该研究成果发表在《Journal of Biomedical Science》杂志上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在动物模型构建方面，通过基因编辑技术构建了多种基因工程小鼠，如 Nedd4 条件性敲除小鼠、Rorc^Y479F和 Nedd4^C854A敲入小鼠等，用于观察基因变化对 Th17 细胞分化及自身免疫疾病发展的影响。在细胞实验技术上，采用免疫沉淀技术，分析蛋白质之间的相互作用；利用质谱分析，鉴定 RORγt 的泛素化位点；运用慢病毒转导技术，实现基因的转移和表达调控。同时，研究还使用了来自 MS 患者和健康对照的样本队列，进行相关指标的检测和分析。

下面来看具体的研究结果：

• Nedd4 对 Th17 细胞分化的影响：研究人员构建了 Nedd4 条件性敲除小鼠模型，通过体内外实验发现，Nedd4 基因缺失会显著抑制非致病性和致病性 Th17 细胞的分化，而对 Th1、Th2 和诱导性调节性 T 细胞（iTregs）的分化没有明显影响。在体外实验中，使用来自 Nedd4^CreER小鼠的幼稚 CD4⁺T 细胞进行 Th1、Th2、Th17 和 iTreg 细胞分化实验，结果显示，缺乏 Nedd4 的小鼠，其 Th17 细胞分化明显减少。在体内实验中，观察 Nedd4^CreER小鼠肠道固有层的 Th17 细胞，发现经他莫昔芬处理（导致 Nedd4 基因缺失）的小鼠，其肠道固有层中 CD4⁺IL-17⁺T 细胞数量相较于玉米油处理的小鼠明显减少。此外，研究人员还发现，MS 患者的 CD4⁺T 细胞中 NEDD4 和 RORγt 的表达显著增加，且沉默人 CD4⁺T 细胞中的 NEDD4 基因，会抑制 Th17 细胞的增殖和 IL-17 的表达，这表明 Nedd4 对 Th17 细胞分化的调控在人和小鼠中具有保守性。
• Nedd4 对 EAE 发展及抗原特异性 Th17 反应的影响：实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是 MS 的小鼠模型，研究人员利用该模型研究 Nedd4 对 Th17 介导的自身免疫的影响。给 Nedd4^CreER小鼠经他莫昔芬处理后诱导 EAE，发现这些小鼠的 EAE 症状明显减轻。进一步研究发现，在 EAE 诱导过程中，Nedd4 基因缺失的小鼠，其抗原特异性 Th17 反应受损，表现为引流淋巴结（dLN）细胞对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35 - 55（MOG_{35 - 55}）的增殖反应减弱，培养上清液中 IL-17A、IL-6、GM - CSF 等细胞因子水平降低。同时，在 Nedd4 基因缺失小鼠的脊髓中，淋巴细胞浸润减少，CD4⁺IL-17⁺T 细胞数量也明显减少。将 Rorc^CreNedd4^f/f小鼠的 CD4⁺T 细胞过继转移到 Tcrb^-/-小鼠中，再诱导 EAE，发现接受过继转移的小鼠对 EAE 诱导具有抗性，且 Th17 反应缺陷，这进一步证实了 Nedd4 在致病性 Th17 细胞发展和 EAE 发展中的重要作用。
• RORγt 与 Nedd4 的相互作用：通过序列分析，研究人员发现 RORγt 配体结合域的羧基末端存在一个 PPLYKEL 基序，该基序是 Nedd4 WW 结构域的潜在结合基序。免疫共沉淀实验表明，Nedd4 在 Th17 细胞中与 RORγt 组成性结合，且这种结合在 CD3/CD28 刺激后增强。进一步实验发现，Nedd4 的 WW 结构域能够与 RORγt 结合，而缺失 WW 结构域的 Nedd4 则不能与 RORγt 结合。将 RORγt 的 PPLY 基序突变为 PPLF 后，Nedd4 与 RORγt 的相互作用消失。研究还发现，RORγt^Y479F突变小鼠表现出与 RORγt 缺陷小鼠相似的表型，如胸腺细胞发育异常和缺乏淋巴结，且接受 RORγt^Y479F小鼠 CD4⁺T 细胞的 Tcrb^-/-小鼠对 EAE 诱导具有抗性，Th17 反应缺陷，这表明 RORγt 的 PPLY 基序对其功能至关重要。
• Nedd4 对 RORγt 的泛素化修饰：研究人员通过一系列实验证实，Nedd4 是 RORγt 的 E3 泛素连接酶。转染实验表明，Nedd4 能够诱导 RORγt 泛素化，而缺乏 E3 泛素连接酶活性的 Nedd4^C867A突变体则不能。体内实验也发现，Nedd4^C854A敲入小鼠的 T 细胞中，RORγt 泛素化被消除，且这些小鼠的 EAE 严重程度显著降低，Th17 反应受损。进一步研究发现，RORγt 发生的是 K27 连接的多聚泛素化，而不是 K48 或 K63 连接的多聚泛素化。在 Th17 细胞中，Nedd4 介导的 RORγt 的 K27 连接多聚泛素化能够增强 RORγt 的活性，促进 Th17 细胞分化。通过质谱分析和定点突变实验，研究人员确定了 RORγt 的 K112 位点是 Nedd4 介导的泛素化位点，突变该位点会消除 RORγt 的泛素化，抑制 Th17 细胞分化。

综合研究结论和讨论部分，此项研究首次揭示了 Nedd4 通过对 RORγt 进行 K27 连接的多聚泛素化修饰，增强其活性，进而调控 Th17 细胞分化和自身免疫疾病发展的分子机制。这一发现不仅丰富了人们对 Th17 细胞分化调控机制的认识，也为治疗 Th17 介导的自身免疫疾病提供了新的潜在治疗靶点。然而，该研究也存在一些局限性，如尚未明确 Nedd4 与 RORγt 结合的精确位点，以及 Nedd4 在 Th17 细胞分化过程中的激活机制。尽管如此，这项研究依然为后续相关研究指明了方向，有望推动自身免疫疾病治疗领域的进一步发展。