《Molecular Medicine》揭秘 RTN3 与肺纤维化的神秘关联：新发现的致病 “密码”？

为探究 RTN3 在肺纤维化中的作用及机制，中南大学研究人员开展相关研究。结果发现 RTN3 水平降低可促肺纤维化，还鉴定出相关突变。该研究为肺纤维化诊疗提供新方向，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在医学领域，有一种疾病如同隐藏在肺部的 “恶魔”，严重威胁着人们的健康，它就是特发性肺纤维化（IPF）。这是一种进行性且致命的间质性肺疾病，患者的肺泡结构被破坏，大量细胞外基质沉积，肺部布满瘢痕，炎症细胞不断浸润，最终呼吸功能衰竭 。流行病学研究显示，IPF 的患病率在不同地区有所差异，亚太国家每 10 万人中有 0.57 - 4.51 人患病，欧洲为 0.33 - 2.51 人，北美则是 2.40 - 2.98 人。近年来，IPF 患者的 5 年死亡率更是超过了 50%，比许多癌症的死亡率还高。然而，目前 IPF 的发病机制和具体机制仍如同迷雾一般，尚未完全明确。

肺泡上皮细胞损伤、肺成纤维细胞的增殖与激活，是诱导肺纤维化的关键因素 。之前的研究发现，表面活性剂蛋白相关基因和端粒相关基因的变异，可能会导致肺泡上皮细胞受损，进而引发 IPF 。肺损伤后，成纤维细胞被激活并转化为肌成纤维细胞，促使包括胶原蛋白、α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）和波形蛋白（Vim）等纤维化标志物的产生，最终形成瘢痕，导致 IPF 。但目前成纤维细胞与纤维化标志物之间的调控机制还不清楚。此外，巨噬细胞也是影响肺纤维化的重要细胞，尤其是肺泡中促纤维化巨噬细胞的分化，在 IPF 进程中起着关键作用 。

在这样的背景下，一种名为网状蛋白 3（RTN3）的内质网蛋白进入了科研人员的视野。RTN3 在神经退行性疾病、脂质代谢和慢性肾脏疾病中都扮演着重要角色 。中南大学的研究人员对 RTN3 产生了浓厚的兴趣，他们想知道，这个在其他领域 “小有名气” 的蛋白，在肺纤维化中是否也有着不可忽视的作用呢？为了解开这个谜团，他们展开了深入研究，相关成果发表在《Molecular Medicine》期刊上，论文标题为 “RTN3 regulates collagen biosynthesis and profibrotic macrophage differentiation to promote pulmonary fibrosis via interacting with CRTH2”。研究最终发现，RTN3 在肺部起着重要作用，其水平降低可能是 IPF 及相关疾病的一个危险因素。这一发现为深入了解肺纤维化的发病机制提供了新的线索，也为未来开发治疗肺纤维化的新方法带来了希望。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法。他们从公共数据库获取数据进行分析，同时收集 IPF 患者和健康对照者的肺组织样本进行研究。通过构建基因工程小鼠模型，特别是 RTN3 基因敲除小鼠，来观察 RTN3 缺失对肺纤维化的影响。在细胞实验方面，他们分离培养了原代肺成纤维细胞和肺泡巨噬细胞，并对细胞进行处理和检测。还运用了蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫共沉淀（co - IP）、RNA 测序（RNA - seq）、实时荧光定量聚合酶链式反应（real - time PCR）等实验技术，从基因、蛋白等多个层面探究 RTN3 与肺纤维化之间的关系。

下面我们一起来看看具体的研究结果。

1. 低表达 RTN3 与 IPF 的紧密联系：研究人员首先分析了公共数据库中 IPF 患者的 RTN3 RNA 水平，发现 IPF 患者肺组织中 RTN3 的 mRNA 水平比健康组低 。接着，他们构建了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，通过免疫组织化学（IHC）和蛋白质免疫印迹分析发现，肺纤维化越严重（博来霉素使用时间越长），RTN3 的表达越低 。在体外实验中，用转化生长因子 β（TGF - β）处理人胚肺成纤维细胞 MRC5，随着 TGF - β 处理时间延长，肺纤维化标志物表达升高，而 RTN3 表达降低 。最后，对 IPF 患者和健康对照者的肺组织样本进行 IHC 分析，也得出了肺纤维化越严重，RTN3 表达越低的结论 。这些在数据库、小鼠和细胞系中的发现，都表明低表达 RTN3 与 IPF 之间存在紧密联系。

2. RTN3 缺乏加剧肺纤维化：研究人员构建了 RTN3 基因敲除小鼠，将 8 周龄的 RTN3 基因敲除小鼠和野生型对照小鼠通过气管内滴注博来霉素建立肺纤维化小鼠模型。HE 染色和 Masson 染色显示，博来霉素处理后，RTN3 基因敲除小鼠的肺纤维化症状比野生型小鼠更严重 。ELISA 分析发现，博来霉素处理后，RTN3 基因敲除小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中肺表面活性蛋白 A（SP - A）和肺表面活性蛋白 B（SP - B）水平显著降低 。蛋白质免疫印迹分析表明，博来霉素处理后，RTN3 基因敲除小鼠肺组织中肺纤维化标志物 α - SMA、磷酸化 Smad3（p - Smad3）和纤连蛋白 1（Fn1）的水平比野生型小鼠更高 。此外，16 月龄的 RTN3 基因敲除小鼠在未接受任何处理的情况下就出现了肺纤维化，而同龄野生型小鼠则未出现 。ELISA 分析显示，16 月龄的 RTN3 基因敲除小鼠 BALF 中 SP - A 和 SP - B 水平降低 。这些结果表明，RTN3 缺乏会加剧博来霉素诱导的肺纤维化，并使小鼠在老年时出现肺纤维化表型。

3. RTN3 减少促进胶原蛋白合成：对 16 月龄的 RTN3 基因敲除小鼠和野生型小鼠的肺组织进行 mRNA 测序，发现 RTN3 基因敲除小鼠中包括 COL1A1、COL1A2、COL2A1 和 COL3A1 等在内的多个胶原蛋白基因表达显著增加 ，这一结果通过实时荧光定量聚合酶链式反应得到了证实 。蛋白质免疫印迹分析进一步证明，RTN3 基因敲除小鼠肺组织中 COL1A1 的蛋白水平比野生型小鼠高 。在体外实验中，对原代培养的野生型和 RTN3 基因敲除小鼠的肺成纤维细胞以及 MRC5 细胞系进行研究，发现 RTN3 基因敲除小鼠原代肺成纤维细胞中 COL1A1 表达增加，在 MRC5 细胞系中敲低 RTN3 后也得到了类似结果 。同时，RTN3 基因敲除小鼠原代培养的肺成纤维细胞和敲低 RTN3 的 MRC5 细胞系中羟脯氨酸水平也明显升高 。这些研究表明，肺组织或肺成纤维细胞中 RTN3 缺乏会促进胶原蛋白的合成。

4. RTN3 缺乏降低 ER 锚定的 CRTH2 对肺成纤维细胞胶原蛋白合成的拮抗作用：研究人员通过质谱分析发现 CRTH2（辅助性 T 细胞 2 型细胞表达的趋化因子受体同源分子）是与 RTN3 相互作用的新蛋白，这一结果在原代培养的肺成纤维细胞中通过免疫共沉淀得到了验证 。免疫荧光染色显示，RTN3 与 CRTH2 在成纤维细胞的细胞质中共定位 。之前的研究表明，CRTH2 作为前列腺素 D2 的质膜受体，可转运到成纤维细胞的内质网膜上发挥抗纤维化作用，它能通过与 La 核糖核蛋白结构域家族成员 6（LARP6）的胶原蛋白 mRNA 识别基序结合，促进胶原蛋白 mRNA 的降解 。免疫荧光染色显示，在肺成纤维细胞中，CRTH2 可定位在内质网膜上，但在 RTN3 缺陷细胞中，与内质网膜共定位的 CRTH2 显著减少 。对内质网膜分离的蛋白质进行蛋白质免疫印迹分析也表明，野生型小鼠原代肺成纤维细胞中定位在内质网膜上的 CRTH2 蛋白比 RTN3 缺陷细胞中更多 。此外，研究还发现，RTN3 缺失会抑制小鼠原代肺成纤维细胞中胶原蛋白 mRNA（COL1A1 和 COL1A2）的降解，延长其半衰期 。增加 CRTH2 的表达或敲低 LARP6 的表达可以挽救 RTN3 缺乏导致的胶原蛋白 mRNA 降解抑制 。这表明 RTN3 减少可能导致其相互作用蛋白 CRTH2 在内质网中的定位减少，从而减少与 LARP6 的结合，进一步减少肺成纤维细胞中胶原蛋白 mRNA 的降解。

5. 全外显子测序在中国人 ILD 群体中鉴定出 RTN3 基因的功能丧失突变：为了证实 RTN3 与人类肺纤维化的关系，研究人员招募了 124 例间质性肺疾病（ILD）患者。通过全外显子测序，在排除已知的 ILD 致病基因突变后，在两名患者中分别鉴定出 RTN3 的两个突变（c.548A > G/p.E183G） 。构建含有野生型和突变型 RTN3 的质粒并转染到 MRC5 细胞系中，免疫荧光染色显示，c.548A > G/p.E183G 改变了 RTN3 的亚细胞定位 。将突变型或野生型 RTN3 质粒转染到从 RTN3 基因敲除小鼠分离的原代培养肺成纤维细胞中，免疫荧光染色显示，转染野生型 RTN3 质粒的细胞中，CRTH2 与内质网标记蛋白钙连蛋白（CANX）共定位，而转染突变性质粒的细胞中，CRTH2 明显定位在细胞膜和内质网上 ，这表明 RTN3 的 c.548A > G/p.E183G 突变破坏了 CRTH2 的亚细胞定位。ELISA 检测还显示，转染突变性质粒的细胞中羟脯氨酸水平比转染野生型质粒的细胞高得多 。总之，研究人员在间质性肺疾病患者中鉴定出了 RTN3 的两个突变，功能研究表明这些功能丧失突变影响了 CRTH2 的亚细胞定位，并促进了肺成纤维细胞中胶原蛋白的水平，进一步证实了 RTN3、CRTH2 和肺纤维化之间的关系。

6. RTN3 缺乏通过降低 CRTH2 水平促进促纤维化巨噬细胞分化：研究人员发现 CRTH2 还可以通过促进 CD206 的表达和介导促纤维化巨噬细胞分化来促进肺纤维化 。因此，他们检测了野生型和 RTN3 基因敲除小鼠肺组织中 CD206 的水平，IHC 分析显示，RTN3 基因敲除小鼠肺组织中 CD206 的表达比野生型小鼠更多，并且在博来霉素处理的小鼠中这种趋势更加明显 。分离野生型和 RTN3 基因敲除小鼠的肺泡巨噬细胞，实时荧光定量聚合酶链式反应发现，RTN3 基因敲除细胞中促纤维化巨噬细胞生物标志物 CD206、精氨酸酶 1（Arg1）和抵抗素样分子 α（Fizz1）的表达增加 。流式细胞术检测也表明，RTN3 基因敲除细胞中 CD206 的荧光强度比野生型细胞高得多 。蛋白质免疫印迹分析证实，RTN3 基因敲除巨噬细胞中 CRTH2 的水平比野生型细胞明显增加 。进一步研究发现，RTN3 参与自噬小泡的形成，RTN3 基因敲除巨噬细胞中自噬标志物微管相关蛋白轻链 3B（LC3 - B）、Beclin1 和发动蛋白 II（DNM2）的水平明显降低 。免疫荧光染色发现，RTN3 基因敲除小鼠的巨噬细胞中，CRTH2 与自噬小泡的共定位减少，自噬小泡的斑点数量也减少 ，这表明在 RTN3 基因敲除细胞中，自噬小泡更难降解 CRTH2。这些研究证实了 RTN3 促进肺纤维化的另一个作用，即巨噬细胞中 RTN3 水平降低可能会减少 CRTH2 的自噬降解，促进 CRTH2 介导的促纤维化巨噬细胞分化，进而加重年龄或博来霉素诱导的肺纤维化。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：RTN3 水平降低会加剧年龄或博来霉素诱导的肺纤维化，这一过程部分是通过增加胶原蛋白沉积实现的。具体来说，RTN3 减少会降低内质网锚定的具有抗纤维化作用的 CRTH2 水平，从而促进胶原蛋白合成；同时，RTN3 减少还会抑制自噬小泡的形成，减少 CRTH2 被自噬降解，进而促进促纤维化巨噬细胞分化 。此外，研究人员还在 ILD 患者中鉴定出了 RTN3 的两个突变，这些突变影响了 CRTH2 的亚细胞定位，进一步证实了 RTN3 与肺纤维化的关系。

这项研究具有重要意义。首先，它首次建立了 RTN3 与肺纤维化之间的联系，揭示了 RTN3 在肺纤维化发病机制中的重要作用，为深入理解肺纤维化的发病过程提供了新的视角。其次，研究表明 RTN3 可能是一种新的肺纤维化致病基因，这为未来开发针对肺纤维化的诊断方法和治疗策略提供了潜在的靶点。如果能够针对 RTN3 或其相关通路进行干预，或许可以为 IPF 患者带来新的希望，改善他们的预后，提高生活质量。相信在未来，随着对 RTN3 和肺纤维化关系的进一步研究，医学领域在攻克这一难题上会取得更大的突破。