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为解决大肠杆菌耐药及基因组编辑难题，四川师范大学研究人员开展 TnpB 和 IscB 在大肠杆菌中基因组编辑研究。结果发现其在不同菌株编辑效果不同并成功应用。该研究为研发抗菌药提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。
在微生物的世界里，一场没有硝烟的战争正在打响，那就是细菌的耐药性问题。如今，微生物耐药已经成为全球都为之头疼的难题，它对医疗系统的冲击实在太大了！其中，大肠杆菌（Escherichia coli）又是耐药微生物中极为常见的一种，这就迫切需要人们研发新的抗菌药物来对付它。
以往，开发新型抗生素是对抗耐药菌的常用策略，可这办法并不能很好地解决不断出现的耐药问题。近年来，RNA 引导的 DNA 核酸酶崭露头角，它能精准地靶向 DNA，还具备高效的基因组编辑能力，给消除耐药微生物带来了新希望。在这些核酸酶里，CRISPR-Cas9（规律成簇间隔短回文重复序列及其相关核酸酶 9 ）备受关注，有研究报道它能用来消灭特定菌株。但 CRISPR-Cas9 也有个大麻烦，Cas9 蛋白个头太大了，有 1053 - 1368 个氨基酸，这使得它很难有效进入靶细胞发挥作用。所以，找到更小的 RNA 引导的 DNA 核酸酶来对付耐药微生物，就成了科研人员们的当务之急。
在这样的背景下，四川师范大学生命科学学院的研究人员 Hongjie Tang、Jie Gao 等人在《Communications Biology》期刊上发表了一篇名为 “Characterization of the genome editing with miniature DNA nucleases TnpB and IscB in Escherichia coli strains” 的论文。他们发现，小型 DNA 核酸酶 TnpB（转座子相关转座酶 B ）和 IscB（插入序列 Cas9 样蛋白 B ）在不同的大肠杆菌菌株中有着不同的基因组编辑效果，还成功应用它们实现了大肠杆菌的基因组编辑，这为开发新型抗菌药物奠定了重要基础。
为了开展这项研究，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是转化实验，他们把携带 TnpB、IscB 或 enIscB（增强型 IscB ）的质粒转入不同的大肠杆菌菌株，通过计算转化效率来判断这些蛋白对菌株的毒性。接着是切割活性检测，将携带核酸酶的质粒和靶向特定基因的 ωRNA 质粒一起转入大肠杆菌，根据转化效率判断核酸酶能否切割靶基因。还有基因缺失效率验证，通过向培养的大肠杆菌中添加阿拉伯糖诱导 λ - Red 系统表达，然后将含有同源臂的质粒或线性双链 DNA 与携带核酸酶的质粒共电转，再用菌落 PCR 和测序来确定基因缺失效率 。最后是质粒消除实验，采用两步质粒消除策略去除参与基因组编辑的质粒。
下面来看看具体的研究结果。
TnpB-based genome editing tools worked in MG1655 but not in ATCC9637 and BL21(DE3)
研究人员先拿 TnpB 开刀，探索它在大肠杆菌中的基因组编辑效率。TnpB 可是目前已知最小的可编程 RNA 引导的 DNA 核酸酶。他们把携带 TnpB 的质粒 p15A-TnpB 和对照质粒 pCK1 分别转入大肠杆菌 MG1655、ATCC9637 和 BL21 (DE3)。结果发现，p15A-TnpB 在 MG1655 和 BL21 (DE3) 中的转化效率只是略低于 pCK1，说明 TnpB 对这两种菌株毒性较小；但在 ATCC9637 中，p15A-TnpB 的转化效率大幅下降，就算减少 TnpB 的拷贝数也无济于事，这表明 TnpB 对 ATCC9637 有毒性，不适合在这个菌株中进行基因组编辑。
接着，研究人员在 MG1655 和 BL21 (DE3) 中测试 TnpB 的切割活性。他们把含有 20bp 靶 DNA 序列和 TAM（靶相邻基序）的质粒转入这两种菌株，发现 pωRNA-TnpB-maeB 或 pωRNA-TnpB-umuDC 在 MG1655 中的转化效率比对照质粒低了 4 个数量级，而在 BL21 (DE3) 中与对照质粒相似，这说明 TnpB 在 MG1655 中有切割基因组 DNA 的活性，在 BL21 (DE3) 中则没有。
为了修复 TnpB 在 MG1655 中切割形成的双链断裂（DSB），研究人员尝试用线性双链 DNA 形式的同源臂和相应的 pωRNA-TnpB-targetX 质粒共电转，结果没得到阳性菌落。后来，他们把同源臂插入 pωRNA-TnpB-maeB 或 pωRNA-TnpB-umuDC 中，再进行电转，成功删除了 maeB 和 umuDC 基因，编辑效率分别达到 30% 和 100% ，这表明在 MG1655 中使用 TnpB 实现基因删除，需要以质粒形式提供同源臂。
Efficient genome editing could be achieved in ATCC9637 and BL21(DE3) by using IscB but not in MG1655
TnpB 在应用上有局限性，研究人员便把目光投向了同样个头小的 IscB 蛋白。他们把 pSC101-IscB 质粒和 pCK1 质粒转入大肠杆菌 MG1655、ATCC9637 和 BL21 (DE3)，发现 IscB 对 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 毒性较小，但对 MG1655 毒性很大，所以后续只在 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 中测试 IscB 的切割活性。
研究人员用含有 16bp 靶 DNA 序列和 TAM 的质粒评估 IscB 的切割活性，发现 pωRNA-IscB-rpoS、pωRNA-IscB-maeB 或 pωRNA-IscB-umuDC 在 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 中的转化效率明显低于对照质粒，这说明 IscB 能在这两种菌株中切割靶基因。
研究人员进一步测试 IscB 在这两种菌株中的基因删除效率，把线性双链 DNA 形式的同源臂和相应的 pωRNA-IscB-targetX 质粒共电转，结果显示 maeB 和 umuDC 基因的删除效率分别为 50% 和 80% ，rpoS 基因的编辑效率在 30% - 60% 之间。而且，增加 IscB 的拷贝数，并没有显著提高基因组编辑效率。
Genome editing in E. coli ATCC9637 and BL21(DE3) could also be achieved by using enIscB
之前有研究优化了 IscB 蛋白，得到了 enIscB 系统，在真核细胞中碱基编辑效率大幅提升。研究人员也想看看 enIscB 在大肠杆菌中能不能提高基因组编辑效率。
他们把 pSC101-enIscB 质粒和 pCK1 质粒转入三种大肠杆菌菌株，发现 enIscB 对 MG1655 毒性较大，对 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 毒性较小，所以只在 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 中测试切割活性。结果发现，enIscB 能高效切割这两种菌株中的 rpoS、maeB 和 umuDC 基因。
在评估 enIscB 的基因组编辑效率时，研究人员把同源臂和相应的 pωRNA-IscB-targetX 质粒共电转，发现 rpoS 基因的编辑效率在 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 中能达到 70% ，maeB 和 umuDC 基因的编辑效率在 10% - 40% 之间。增加 enIscB 的拷贝数后，编辑效率并没有明显变化，这说明 enIscB 系统和 IscB 系统的编辑效率相当。
Plasmid elimination in TnpB/IscB/enIscB-based genome editing systems was achieved by a two-step plasmid curing strategy
参与基因组编辑的质粒得去掉，才能方便后续的表型测试和更多轮的基因组编辑。研究人员采用了两步质粒消除策略，先去除 pωRNA 质粒系列，再去除 pTnpB/pIscB/penIscB 质粒。以 MG1655 中含有 pSC101-TnpB 的 maeB 突变体为例，经过一系列操作，成功消除了相关质粒，而且这种方法在不同菌株中的质粒消除效率都还不错，这表明用两步质粒消除策略可以成功去除 TnpB/IscB/enIscB 基因组编辑系统中的质粒。
Preliminary uncovering the mechanisms of E. coli escaping from TnpB/IscB-based genome editing
微生物在 RNA 引导的 DNA 核酸酶切割下可能存活，这些存活的微生物被称为 “escapers”。研究人员以 maeB 基因为靶点，发现 MG1655 中 maeB 编辑的逃逸率约为 10?? ，ATCC9637 中与之相似，BL21 (DE3) 中较低，为 2×10?? 。
他们分析了逃逸菌株中表达 TnpB/IscB 或 ωRNA 的质粒大小，还对相关编码区域进行测序，发现 ωRNA 编码序列的突变是大肠杆菌在 TnpB/IscB 介导的基因组编辑中逃逸的主要原因，而且这些突变大多分布在 ωRNA 编码序列的 5’端。
总的来说，这项研究系统地探究了 TnpB、IscB 和 enIscB 在不同大肠杆菌菌株中的应用。成功在 MG1655 中建立了基于 TnpB 的基因组编辑工具，在 ATCC9637 和 BL21 (DE3) 中利用 IscB 和 enIscB 实现了基因组编辑，还成功消除了编辑质粒，并初步揭示了大肠杆菌在 TnpB/IscB 编辑下的逃逸机制。
TnpB、IscB 和 enIscB 比 Cas9 小很多，这在基因组编辑应用上有很大优势。它们为对抗耐药微生物提供了新的研究思路和方法，有望开发出新型抗菌药物。此外，进一步研究 TnpB 和 IscB 家族，还能拓展它们在紧凑型 CRISPR 工具箱中的功能，为基础细胞研究带来新的视角。可以说，这项研究成果就像一把钥匙，为解决大肠杆菌耐药问题和基因组编辑研究打开了新的大门，让人们在对抗耐药菌的道路上又前进了一大步。
