揭秘肺炎克雷伯菌噬菌体耐药 “密码”：CPS 突变与新机制开启噬菌体疗法新篇

为解决噬菌体耐药影响临床噬菌体疗法的问题，西南医科大学研究人员开展 K54 高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体耐药进化研究，发现 CPS 突变是主要耐药策略且有新机制。推荐科研读者阅读，助您深入了解相关耐药机制，为噬菌体疗法研究提供思路。

　　

在如今的医学领域，抗生素耐药问题如同一场可怕的瘟疫，给传染病的防控带来了巨大的挑战。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为一种重要的机会致病菌，能引发菌血症、泌尿道和呼吸道感染，还有化脓性肝脓肿等多种疾病 。其中，碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌在全球范围内出现，世界卫生组织在 2017 年就将其列为重点关注的细菌。而高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）更是能在健康人群中引发危及生命的感染，社区和医院里都有它作恶的身影。当碳青霉烯耐药和高毒力这两个特性同时出现在肺炎克雷伯菌身上时，控制其引发的感染就变得难上加难。

在这样艰难的处境下，噬菌体疗法（依靠噬菌体靶向并杀死细菌的治疗方法）作为对抗碳青霉烯耐药的 hvKp 感染的替代疗法，重新进入了人们的视野，获得了新的关注。越来越多成功的临床噬菌体治疗案例被报道出来，让人们看到了战胜耐药菌感染的希望。然而，细菌对噬菌体产生耐药性这个问题，就像一块巨石，横在了噬菌体疗法的发展道路上。在众多噬菌体防御机制中，与噬菌体受体相关的基因突变被认为是细菌最常用的策略。在肺炎克雷伯菌中，荚膜多糖（CPS）是大多数噬菌体的主要受体，此外，脂多糖（LPS）、主要孔蛋白 OmpK36 或铁载体受体 FepA 也能作为结合受体引发感染。在噬菌体治疗过程中，细菌很容易产生耐药突变体，这些突变体往往伴随着细菌适应性和毒力的改变，有的还会对抗生素更敏感。因此，弄清楚治疗过程中噬菌体耐药性的演变，对于噬菌体疗法的成功实施至关重要。

为了解决这些棘手的问题，西南医科大学基础医学院的研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了一篇名为 “Capsule mutations serve as a key strategy of phage resistance evolution of K54 hypervirulent Klebsiella pneumoniae” 的论文。研究发现，CPS 突变是介导体外和体内条件下噬菌体耐药性进化的主要原因，而且这些突变会让 hvKp SCNJ1 的细菌适应性和毒力减弱。此外，bglA 基因突变也能介导噬菌体耐药性，并且携带这种突变的细菌在适应性和毒力方面没有下降。这一研究成果为临床噬菌体疗法提供了重要的理论依据，就像是在黑暗中为研究者们点亮了一盏明灯。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。他们通过体外噬菌体 - 细菌共培养和体内肺炎治疗实验，对宿主 hvKp SCNJ1 施加了强大的选择压力。在实验过程中，运用了多种检测手段，像倒点滴平板试验和 EOP 实验来筛选和鉴定噬菌体耐药突变体；通过全基因组测序技术，对耐药突变体的基因变化进行分析；还利用透射电子显微镜、生物膜形成实验、血清杀菌实验、小鼠感染实验等多种方法，对耐药突变体的表型特征、抗血清和吞噬能力、毒力等方面进行研究。这些技术方法就像一套精密的组合拳，帮助研究人员一步步揭开噬菌体耐药性的神秘面纱。

下面让我们一起来看看研究的具体结果。

1. 噬菌体耐药突变体的筛选与鉴定：研究人员用两种噬菌体（podovirus vB_KpnA_SCNJ1-Z 和 siphovirus vB_KpnS_SCNJ1-C）对 hvKp SCNJ1 进行筛选。经过长时间（12 小时）的细菌 - 噬菌体共培养，在体外筛选出 18 个自发耐药突变体；从感染 SCNJ1 并经噬菌体治疗的小鼠肺部，又筛选出 19 个耐药克隆。通过倒点滴平板试验、EOP 实验和生长动力学试验，确认了这些突变体的耐药性。结果发现，除了 ZM9 和 ZR7 是部分耐药外，其他突变体都对相应噬菌体表现出完全耐药。而且，对 SCNJ1-C 耐药的分离株都对 SCNJ1-Z 耐药，对 SCNJ1-Z 耐药的分离株（除 ZR7 和 ZM9 外）也对 SCNJ1-C 耐药，这表明这两种噬菌体可能利用相同的受体。而对另一种噬菌体 vB_KpnM_SCNJ1-Y 的交叉耐药性测试显示，只有两个耐药突变体对其完全耐药，说明这种噬菌体可能探索了其他受体。这就好像噬菌体和细菌在进行一场复杂的 “捉迷藏” 游戏，它们不断地改变策略，寻找着彼此的弱点。
2. 噬菌体耐药突变体的表型特征：野生型 SCNJ1 在 LB 血琼脂平板上的菌落呈黏液状，又大又光滑，表面湿润（“msbw” 形态）。而大多数耐药突变体呈现非黏液状，菌落小且表面干燥（“nmsd” 形态），这意味着它们失去了荚膜，但有三个突变体（CR5、CM8 和 ZM10）和 SCNJ1 的形态相似。通过拉丝试验和沉降试验发现，“msbw” 形态的突变体保留了高黏液性（Hmv）表型，“nmsd” 形态的则大多变成了低黏液性。不过，“msbw” 形态的 CR5 在沉降试验中被认为是 Hmv，但拉丝长度却不足 5 毫米，当将野生型 wzc基因导入 CR5 后，拉丝试验才恢复阳性，其中的原因还有待进一步探索。在生长动力学方面，一些突变体（如 CM1、CM3、CM19、CM20、CM22、ZM10 和 ZR9）的生长速度明显比 SCNJ1 慢，这暗示着它们可能付出了适应性的代价。在抗生素敏感性测试中，虽然部分突变体对一些抗生素的抑菌圈直径有所增加，但按照临床和实验室标准协会（CLSI）的阈值判断，噬菌体耐药性进化并没有使细菌的耐药性发生实质性变化。这一系列结果就像是一幅复杂的拼图，每一块都蕴含着细菌耐药性变化的奥秘。
3. 与噬菌体耐药相关的基因变化：研究人员对 37 个噬菌体耐药突变体进行全基因组测序，将其与亲本 SCNJ1 参考基因组比对后发现，共检测到 68 个突变，涵盖 27 种不同的突变类型，其中 24 个突变会影响编码蛋白的功能。有趣的是，所有体内样本的耐药分离株在甘油激酶基因 glpK上都有一个同义突变（A77A，GCC→GCT），而未处理小鼠肺部的样本中没有这个突变，这表明该突变很可能是噬菌体和小鼠体内环境（如免疫系统）共同选择的结果。在噬菌体感染过程中，CPS 是肺炎克雷伯菌噬菌体的吸附受体，CPS 合成相关基因突变是噬菌体耐药的常见原因。在这次研究中，绝大多数（36/37，97.3%）的耐药分离株在 CPS 生物合成途径相关基因上至少有一个突变。其中，cps 操纵子中的 wcaJ基因（编码糖基转移酶）突变最为频繁，有 21/37 的耐药分离株出现该基因突变，突变类型包括错义突变、无义突变、缺失突变、移码突变以及 IS5 插入突变等。这些 wcaJ突变体大多呈现 “nmsd” 形态，噬菌体对它们的吸附能力明显受损，说明荚膜可能丢失了。wzc基因（编码酪氨酸蛋白激酶）突变在 9 个耐药分离株中被检测到，多数 wzc突变体也是 “nmsd” 菌落，噬菌体对其吸附减少，但 CR5 和 ZM10 这两个突变体比较特殊，它们的 wzc基因发生氨基酸替换后，菌落形态与 SCNJ1 相似，噬菌体对 CR5 的吸附仅比 SCNJ1 低约 10%，而对 ZM10 的吸附则大幅降低。此外，还有一些其他与 CPS 生物合成途径相关的突变，如 wzI、ctg_01605 等基因的突变，这些突变体通常也呈现 “nmsd” 外观，噬菌体吸附能力下降。值得一提的是，菌株 CM8 是唯一不携带 CPS 生物合成相关基因突变的耐药克隆，它的 bglA基因（编码 6 - 磷酸 - β - 葡萄糖苷酶）发生了氨基酸替换（D387N），补回野生型 bglA基因后，CM8 恢复了对噬菌体的敏感性，这表明 bglA基因在肺炎克雷伯菌的噬菌体耐药性中起着重要作用。这就像是在细菌的基因世界里进行了一场大冒险，研究人员发现了许多与噬菌体耐药性紧密相关的基因 “宝藏”。
4. 噬菌体耐药不只是因为荚膜缺失：研究人员挑选了 CR5、ZM10、CM22 和 CM8 这几个有代表性的突变体进一步研究。透射电子显微镜图像显示，CM22 没有荚膜，而 CR5、ZM10 和 CM8 的表面有荚膜，和野生型 SCNJ1 一样。通过糖醛酸定量检测发现，CM22 的 CPS 含量显著降低，而 CR5、ZM10 和 CM8 的 CPS 含量与 SCNJ1 相当。这说明除了荚膜的缺失或改变，还有其他未知的机制参与了噬菌体耐药性的进化。就好像细菌在对抗噬菌体时，不仅依靠改变荚膜这一招，还有其他隐藏的 “秘密武器”。
5. 噬菌体耐药突变体对血清和吞噬作用的抵抗能力不同：生物膜形成是肺炎克雷伯菌致病过程中的重要环节。研究人员比较了噬菌体耐药突变体和野生型 SCNJ1 的生物膜形成能力，发现 ZM10 在 12 小时、24 小时和 48 小时的生物膜形成能力都明显低于 SCNJ1，CR5 在 24 小时和 48 小时的生物膜形成能力也显著降低，CM22 在 24 小时的生物膜形成能力下降，不过在 48 小时与 SCNJ1 没有明显差异，而 CM8 的生物膜形成能力与野生型 SCNJ1 相当，这表明不同的 wzc基因突变对细菌生物膜形成的影响不同，bglA基因在生物膜形成中似乎作用不大。在血清杀菌实验中，75% 血清处理 3 小时后，CM22 几乎全部死亡，野生型 SCNJ1 却能在血清中存活并繁殖，ZM10 虽然能存活，但生长能力比 SCNJ1 弱，而 CR5 和 CM8 对血清的抵抗力增强，存活细菌数量比 SCNJ1 多。在体内吞噬实验中，CM22 被肺泡巨噬细胞吞噬的效率比野生型 SCNJ1 高 1.86 ± 0.24 倍，而 CR5、ZM10 和 CM8 被吞噬的数量明显少于 SCNJ1。这一系列结果表明，不同的基因突变对细菌在血清中的存活和抵抗吞噬作用的能力有不同影响，就像给细菌穿上了不同 “防护等级” 的铠甲。
6. 除 CM8 外，噬菌体耐药菌株在小鼠中的毒力减弱：为了比较噬菌体耐药突变体和野生型 SCNJ1 的毒力，研究人员用不同菌株感染 BALB/c 小鼠并观察它们的存活情况。结果发现，感染野生型 SCNJ1 的小鼠在 48 小时内全部死亡，而感染 ZM10 或 CM22 的小鼠在 7 天内全部存活，CR5 感染的小鼠死亡率则介于两者之间，这说明 ZM10 和 CM22 的毒力显著降低，CR5 的毒力也有所减弱，这体现了 wzc基因在高毒力肺炎克雷伯菌毒力中的重要作用。相比之下，感染 CM8 的小鼠和感染野生型 SCNJ1 的小鼠表现相似，48 小时死亡率达到 100%，说明 CM8 的 bglA基因突变对其毒力影响较小。这就好比不同的突变让细菌在小鼠体内的 “杀伤力” 发生了变化，CM8 却像是一个 “例外”，保持了较强的毒力。
7. 除 CM8 外，噬菌体耐药突变体在小鼠中的定植、传播和致病性下降：研究人员通过给小鼠感染不同菌株，检测感染 48 小时后小鼠器官中的细菌载量，来评估噬菌体耐药突变体在小鼠体内的定植和致病能力。结果显示，野生型 SCNJ1 在肺、肝和脾中的细菌载量明显高于 CR5、ZM10 和 CM22，说明这些突变体的定植能力大幅下降。而 CM8 在肺中的细菌载量虽然比 SCNJ1 低，但在肝和脾中的细菌载量与 SCNJ1 相近，表明 CM8 在小鼠体内仍具有较强的定植和传播能力。对小鼠肺组织进行组织病理学分析发现，感染 SCNJ1 的小鼠肺组织受损严重，有大量红细胞和渗出物；感染 CM8 的小鼠肺组织有广泛的炎症细胞浸润和明显出血；感染 CR5 的小鼠肺组织只有散在的炎症区域；感染 ZM10 和 CM22 的小鼠肺组织则没有明显病理变化。这进一步证明了 wzc基因突变使高毒力肺炎克雷伯菌的毒力显著减弱，而 bglA基因突变的影响较小。这一系列实验结果就像是给细菌在小鼠体内的 “活动” 拍了一部详细的纪录片，清楚地展示了它们的变化。
8. 噬菌体治疗可挽救 CM8 感染的小鼠：由于 CM8 具有完整的毒力和与野生型 SCNJ1 相当的体内适应性，研究人员用能在体外裂解 CM8 的噬菌体 vB_KpnM_SCNJ1-Y 对感染 CM8 的小鼠进行治疗实验。结果发现，接受噬菌体治疗的小鼠全部存活，而接受 PBS 处理的小鼠在 48 小时的存活率为 80%，到第 3 天全部死亡。这表明噬菌体 vB_KpnM_SCNJ1-Y 对治疗像 CM8 这样具有完全毒力的噬菌体耐药突变体感染具有很大的潜力。这无疑给噬菌体疗法带来了新的希望，就像在黑暗中找到了一条光明的道路。

综合以上研究结果，在这项研究中，研究人员构建了 K54 高毒力肺炎克雷伯菌 SCNJ1 的噬菌体耐药进化模型。他们发现，在体外和体内条件下，CPS 突变都是介导噬菌体耐药性进化的主要策略，相关突变会导致细菌适应性和毒力下降。而 bglA基因突变介导的噬菌体耐药机制比较特殊，它不会使细菌的适应性和毒力受损，这是一种新发现的高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体耐药机制。此外，研究还表明不同的 wzc基因突变通过不同机制介导噬菌体耐药性，荚膜的变化在肺炎克雷伯菌噬菌体耐药性发展中起着主导作用。同时，研究人员还验证了噬菌体 vB_KpnM_SCNJ1-Y 对治疗 CM8 感染小鼠的有效性，为噬菌体疗法提供了实践依据。

不过，这项研究也存在一些局限性。比如，虽然研究人员希望找出体外和体内条件下不同的噬菌体耐药模式，但并没有发现实质性差异，未来可能需要更多独立的细菌培养和池测序来揭示潜在的差异。而且，研究中使用的两种噬菌体都靶向肺炎克雷伯菌的荚膜多糖受体，这可能导致耐药途径的多样性较低。另外，关于 bglA基因突变如何赋予噬菌体耐药性并保持细菌的全部毒力，以及 wzc基因突变为何会导致不同的表型特征，这些问题还需要进一步深入研究。

尽管如此，这项研究的意义依然重大。它让我们对高毒力肺炎克雷伯菌的噬菌体耐药机制有了更深入的了解，为临床噬菌体疗法提供了重要的理论基础。就像为噬菌体疗法这座大厦添砖加瓦，让它变得更加坚固，也为未来进一步优化噬菌体疗法、克服噬菌体耐药问题指明了方向，激励着更多的科研人员在这个领域不断探索，为解决抗生素耐药危机带来新的曙光。