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为解决 CDI 疫苗研发难题，弗吉尼亚大学研究人员开展 TcdB 疫苗佐剂研究。结果显示 GLA 3M - 052 LS 佐剂效果优异。此研究为开发下一代 CDI 疫苗提供方向，极具科研价值，推荐一读。
在医疗领域，有一种细菌常常让医生和患者都头疼不已，它就是艰难梭菌（Clostridioides difficile） 。这是一种革兰氏阳性、能形成芽孢的厌氧菌，特别喜欢在医院等卫生环境里捣乱。它会引发抗生素相关性严重腹泻，给患者带来极大的痛苦。
艰难梭菌之所以这么厉害，主要是因为大多数有毒菌株会产生两种主要的外毒素：毒素 A（TcdA）和毒素 B（TcdB）。这些毒素就像 “小恶魔” 一样，会破坏宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架，从而引发艰难梭菌感染（CDI） 。目前已经发现至少 8 种 TcdB 亚型，而且临床上还分离出了有毒的 TcdA?TcdB?菌株。研究发现，TcdB 自己就能引发一系列疾病，堪称艰难梭菌致病的 “头号元凶”。
让人头疼的是，目前还没有能有效预防 CDI 的疫苗。像之前赛诺菲 - 巴斯德的 “Cdiffense” 和辉瑞的 “CLOVER” 这两款疫苗，在三期临床试验中都失败了，接种疫苗的人群并没有比对照组得到更有效的保护，至于失败的原因，目前还不清楚。在美国，每年因 CDI 死亡的人数高达 20000 人，相关的医疗费用超过 48 亿美元，主要就是因为疾病的复发。所以，开发一种新的、比现有疫苗更有效的 CDI 疫苗迫在眉睫，这就需要找到一种药学上可接受的、免疫效果比明矾更好的佐剂。
为了解决这个难题，来自弗吉尼亚大学的研究人员在《npj Vaccines》期刊上发表了一篇名为 “A dual Toll - like receptor ligand liposome adjuvant enhances systemic and mucosal immune responses against Clostridioides difficile toxin B” 的论文。他们发现，一种含有两种 Toll 样受体（TLR）激动剂的合成脂质体制剂（LS），即 GLA（TLR4）和 3M - 052（TLR7&8）协同作用的 GLA 3M - 052 LS 佐剂，在预防 CDI 方面展现出了巨大的潜力。这一发现为开发下一代 CDI 疫苗带来了新的希望。
研究人员在这项研究中使用了多种技术方法。他们用酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测血浆、粪便等样本中针对 TcdB 的 IgG 和 IgA 抗体滴度；通过尿素破坏 ELISA 测定 IgG 抗体亲和力指数（AI） ，以此评估抗体的亲和力成熟情况；利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系进行体外中和试验，判断血浆抗体对 TcdB 的中和能力；运用 ELISpot 试验来量化记忆 B 细胞（B<sub>MEM</sub>）的数量；还对感染后的小鼠结肠组织进行 RNA 测序（RNAseq） ，分析基因表达变化，探索佐剂调节免疫反应的机制。
下面我们来详细看看研究人员都发现了什么。
不同免疫方案的效果比较
研究人员一开始做了个预实验，就像在黑暗中摸索不同的道路，看看哪条路通向成功。他们用毒素中和试验来测试免疫小鼠血浆样本保护靶细胞的能力。这个试验是观察中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在和毒素 - 血浆混合物孵育后的存活情况。结果发现，用鼻内（IN）方案接种 TcdB - LS 的小鼠，没办法产生能中和毒素的血浆 IgG 反应；而用肌肉注射（IM）方案的小鼠，IgA?记忆 B 细胞反应又很差。不过，当把 IM 和 IN 方案结合起来时，就像找到了一条 “黄金组合” 路线，产生了更平衡的抗体和记忆反应。而 TcdB - 明矾组作为当前艰难梭菌疫苗临床试验的参照标准，由于明矾存在潜在毒性问题，一般不适合鼻内给药，所以该组没有进行 IN 免疫。后续实验中，TcdB - LS 采用混合免疫方案，TcdB - 明矾则采用 IM 方案。
TcdB 特异性免疫反应的比较
研究人员接着比较了不同免疫组小鼠的 TcdB 特异性免疫反应。他们把小鼠分成三组，每组 8 只，分别用佐剂单独免疫（作为对照组）、TcdB - 明矾免疫和 TcdB - LS 免疫，每隔两周免疫一次，一共免疫三次。在第三次免疫四周后观察发现，TcdB - 明矾组和 TcdB - LS 组产生的抗 TcdB IgG1 和总 IgG 滴度差不多。但 TcdB - LS 组有个惊喜的发现，它的 IgG2c 抗体水平明显更高。就好像 TcdB - LS 组的免疫系统接到了更明确的 “战斗指令”，能产生更有针对性的 “战斗武器”。
研究人员还发现，TcdB - LS 组的血浆样本亲和力指数（AI）更高。这意味着这个组的抗体和抗原结合得更紧密，就像钥匙和锁匹配得更好，能更好地发挥中和毒素的作用。而且，只有 TcdB - LS 组在粪便和血浆中检测到了抗 TcdB IgA，这表明 TcdB - LS 能诱导产生局部的免疫反应，在肠道这个 “前线战场” 建立起一道防御屏障。同时，TcdB - LS 组的粪便 IgG 水平也明显更高，血浆和黏膜 IgA 水平之间还存在正相关关系，这说明 TcdB - LS 诱导的免疫反应更全面、更协调。
中和抗体活性和记忆 B 细胞反应
TcdB - LS 组的血浆中和抗体活性比 TcdB - 明矾组强很多。在体外中和试验中，TcdB - LS 组的血浆能更好地保护 CHO 细胞，让它们不被 TcdB 毒素伤害，就像给细胞穿上了一层坚固的 “防护服”。而对照组的血浆则没有这种保护能力。
在评估 TcdB 特异性记忆 B 细胞（B<sub>MEM</sub>）反应时，研究人员通过 ELISpot 试验发现，TcdB - LS 组产生的 TcdB 特异性 IgA?抗体分泌细胞（ASCs）数量明显更多，不过 IgG? ASC 反应两组相似。这说明 GLA 3M - 052 LS 佐剂能更好地激发机体的记忆免疫反应，让免疫系统记住 TcdB 这个 “敌人”，下次遇到时能更快、更有效地做出反应。
两种佐剂保护效果的比较
研究人员想知道这两种佐剂对小鼠的保护效果到底怎么样，于是进行了一项挑战实验。他们在小鼠最后一次免疫四周后，给每只小鼠接种 5×10?个 VPI 10643 菌株的芽孢。结果发现，对照组的小鼠在这场 “战斗” 中败下阵来，而 TcdB - LS 和 TcdB - 明矾免疫的小鼠则完全得到了保护。
不过，TcdB - LS 组还有更出色的表现。研究人员在感染 7 天后进行肠道通透性试验，给小鼠口服 FITC - 葡聚糖，然后检测血浆中它的含量来判断肠道的渗漏情况。结果发现，TcdB - LS 组的肠道通透性更低，这意味着它对肠道的保护更好，能让肠道这个 “城墙” 更坚固，阻挡艰难梭菌的入侵。同时，两个接种疫苗的组细菌载量和毒素产生都有所减少，不过 TcdB - LS 组在保护肠道完整性方面更胜一筹。
佐剂对免疫反应的调节机制
为了深入了解两种佐剂是如何调节免疫反应的，研究人员对感染后 7 天的小鼠结肠组织进行了批量 RNA 测序（RNAseq）。通过主成分分析（PCA）发现，TcdB - 明矾组和 TcdB - LS 组的样本明显分成了不同的簇，这表明它们的转录谱有明显差异。进一步的差异基因表达分析发现，TcdB - LS 组有 764 个差异表达基因（DEGs） ，其中 435 个上调，329 个下调。
研究人员又用基因集富集分析（GSEA）来寻找每个组中显著富集的生物学通路。结果发现，和 TcdB - 明矾组相比，TcdB - LS 组中许多免疫反应和激活相关的基因集都优先上调。这就好比 TcdB - LS 组的免疫系统被 “一键激活”，进入了高度戒备状态，随时准备对抗艰难梭菌的入侵。
总的来说，这项研究意义重大。GLA - 3M - 052 LS 佐剂显著增强了针对 CDI 的全身和黏膜免疫反应、抗体功能以及记忆反应。它不仅提高了抗 TcdB IgG 的反应，还诱导产生了更高亲和力的 IgG 抗体和黏膜 IgA 反应，激发了更强的记忆 B 细胞反应。虽然目前的研究还存在一些局限性，比如性别偏差、免疫途径和抗原剂量对反应的影响等问题还需要进一步研究，而且还需要测试对 TcdB 亚型的交叉保护潜力，以及在感染早期研究转录变化。但这项研究为开发有效的 CDI 疫苗奠定了坚实的基础，让我们在对抗艰难梭菌感染的道路上迈出了重要的一步。相信在未来，随着研究的不断深入，我们一定能开发出更有效的疫苗，战胜这个困扰医疗领域已久的难题，为患者带来更多的希望。
