揭秘金黄色葡萄球菌 “小囊泡” 大作用：解锁乳腺炎防治新密码

为探究S. aureus来源的细胞外囊泡（SaEVs）在乳腺炎中的作用，ETH Zurich 的研究人员开展相关研究。结果发现 SaEVs 可影响 boMdM 的形态、基因表达等。该研究为S. aureus疫苗开发提供新思路，推荐科研读者阅读。

　　

在奶牛养殖的世界里，乳腺炎（mammary gland inflammation）就像一个隐藏在暗处的 “大反派”，给养殖户们带来了无尽的烦恼。它不仅会让牛奶的产量大幅下降，质量大打折扣，还会增加养殖成本，比如增加工作量、导致牛奶被丢弃、降低制作奶酪的适用性，同时还会产生高昂的兽医费用和抗生素治疗费用。可以说，乳腺炎是全球奶牛养殖中最 “烧钱” 的疾病之一，也是奶牛生产周期提前结束和抗菌药物使用增加的主要原因。

而在众多引发乳腺炎的 “元凶” 中，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称S. aureus）格外引人注目。它常常引发无症状或亚临床形式的乳腺炎，这种乳腺炎就像一个 “潜伏者”，很难被养殖户和兽医察觉，却能在挤奶过程中轻易地传播给其他奶牛，进而引发慢性疾病。更让人头疼的是，S. aureus还拥有一套 “防御秘籍”，它能表达一系列抗菌耐药基因，还能形成生物膜并在乳腺细胞内生存，这使得抗生素治疗常常失效。其中，S. aureus基因型 B（GTB）更是 “罪魁祸首” 中的重点关注对象，它具有高传染性和致病性，与乳腺内感染密切相关，还可能污染生牛奶奶酪，给人类带来肠毒素中毒的风险。

面对S. aureus引发的乳腺炎这个难题，科学家们一直在努力寻找解决办法。近年来，研究发现革兰氏阳性菌包括S. aureus，能产生携带毒素和酶的囊泡体，也就是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。这些 EVs 在细菌的生理、致病过程、环境适应和感染中都发挥着关键作用。就像小小的 “运输船”，EVs 里包裹的蛋白质和核酸能免受宿主的降解或中和，在致病过程中扮演着重要角色。在小鼠实验中，已经证实S. aureus的细胞外囊泡（SaEVs）能在乳腺中引起局部炎症反应，还能诱导肺细胞凋亡和引发关节炎。在体外实验中，SaEVs 也能诱导腹膜巨噬细胞和脾细胞产生剂量依赖性的促炎反应。

然而，在乳腺炎的研究领域，关于 SaEVs 对奶牛乳腺的影响，仍有许多未解之谜。虽然已知细菌 EVs 会加剧乳腺内的炎症反应并促进感染，但 SaEVs 对奶牛乳房的促炎作用究竟如何，还没有定论，因为目前还缺乏在奶牛体内评估乳腺对 SaEVs 反应的研究。之前的研究还发现，牛的原代乳腺上皮细胞对 SaEVs 的反应很微弱，这也解释了为什么S. aureus能如此轻易地影响乳腺上皮细胞。但 SaEVs 对奶牛乳房先天免疫系统的影响，依旧是个未知数。

为了揭开这些谜团，来自 ETH Zurich 的研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了一篇名为 “Staphylococcus aureus extracellular vesicles modulate the bovine monocyte-derived macrophage response” 的论文。他们的研究发现，SaEVs 会诱导牛单核细胞衍生的巨噬细胞（boMdM）发生形态变化，导致与促炎和细胞焦亡（pyroptosis，一种炎症性细胞死亡形式）相关的基因表达增加。而且，boMdM 和外周血单个核细胞（PBMCs）对 SaEVs 的细胞和分子反应存在差异。此外，对 SaEVs 的蛋白质组分析还发现了与毒力和抗生素耐药性相关的蛋白质簇，这表明S. aureus可能利用 EVs 逃避宿主防御并在乳腺中定植。这些研究结果为深入了解 SaEVs 在S. aureus感染过程中对宿主的影响提供了新的视角，对未来开发针对S. aureus的疫苗具有重要意义。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。他们运用透射电子显微镜（TEM）、可调电阻脉冲传感技术（TRPS）和蛋白质免疫印迹法（WB）对分离出的 SaEVs 进行表征；采用基于粘附的方法，将 PBMCs 中的单核细胞分化为 boMdM；运用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析基因表达；通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测白细胞介素 1β（IL1β）水平；利用液相色谱 - 高分辨率串联质谱（LC-MS/MS）对 SaEVs 和非 EV 分泌物进行蛋白质组分析。

下面我们来详细看看研究人员都发现了什么。

1. M5512B SaEVs 的分离和表征：研究人员从 M5512B S. aureus菌株中分离出 SaEVs。通过透射电子显微镜观察，发现 SaEVs 呈杯状，大小不一，直径在 80 - 250nm 之间，大部分集中在 100nm 左右，而非 EV 分泌物中则没有这些囊泡和聚集体。蛋白质免疫印迹法证实，SaEVs 提取物中存在S. aureus毒素 α - 溶血素（Hla），而非 EV 分泌物中没有。
2. 牛单核细胞衍生巨噬细胞（boMdMs）的表征：研究人员采用基于粘附的方法，将 PBMCs 中的单核细胞在 7 天的培养期内分化为巨噬细胞。大部分附着细胞呈现出典型的巨噬细胞形态，并且经检测，大多数细胞 CD14 呈阳性，这表明这些细胞确实是巨噬细胞。
3. *M5512B S. aureus分泌物诱导 boMdM 的肌动蛋白细胞骨架变化：研究人员用 SaEVs、非 EV 分泌物或脂磷壁酸（LTA）刺激 boMdM 24 小时后，通过鬼笔环肽染色评估肌动蛋白细胞骨架。结果发现，所有S. aureus*分泌物都能诱导 boMdM 发生形态变化，其中 LTA 刺激后形态变化的细胞最多，SaEVs 次之，非 EV 分泌物最少。而且，培养 24 小时后，在 DNA 通道中除核区域外未检测到额外信号，排除了巨噬细胞胞外陷阱（MET）的存在。
4. boMdM 对 M5512B SaEVs 的促炎反应：研究人员将 boMdM 与 SaEVs 孵育后发现，SaEVs 能显著上调多种典型促炎基因的表达，包括白细胞介素 1β（IL1B）、白细胞介素 6（IL6）、白细胞介素 8（IL8）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素 - γ（IFNG）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、C - X - C 基序趋化因子配体 1（CXCL1）和 C - X - C 基序趋化因子配体 2（CXCL2），这种上调作用与 LTA 相当，且高于非 EV 分泌物。此外，SaEVs 还能显著增加白细胞介素 17A（IL17A）的表达，效果比非 EV 分泌物和 LTA 更明显。同时，β - 肌动蛋白基因（ACTB）的表达也在各种刺激后增加。而乳铁蛋白（LTF）、典型抗炎基因甘露糖受体 C 型 1（MRC1）和精氨酸酶 1（ARG1）的转录丰度在与 SaEVs 孵育后没有变化，白细胞介素 10（IL10）的表达则显著上调。
5. M5512B SaEVs 可能在 boMdM 中启动细胞焦亡而非细胞凋亡：研究人员发现，与 SaEVs 和非 EV 分泌物孵育 24 小时后，boMdM 中细胞凋亡相关基因半胱天冬酶 3（CASP3）、半胱天冬酶 9（CASP9）和 BCL2 相关 X 蛋白（BAX）的表达没有变化。但是，SaEVs 能显著上调 Toll 样受体 2（TLR2）基因和炎症小体相关基因 NLR 家族含 pyrin 结构域 3（NLRP3）的表达，同时伴随着 IL1β 蛋白释放到培养基中的增加，而对照组和非 EV 分泌物组则没有这种现象。这表明 SaEVs 更倾向于在 boMdM 中启动细胞焦亡。
6. boMdM 和外周血单个核细胞（PBMCs）对 M5512B SaEVs 和非 EV 分泌物的差异基因表达反应：研究人员用相同的S. aureus制剂刺激牛 PBMCs 和 boMdM，发现 PBMCs 的形态与 boMdM 不同，PBMCs 包含大量淋巴细胞（T 细胞、B 细胞和自然杀伤细胞）和单核细胞。在基因表达方面，PBMCs 在接触 SaEVs 24 小时后，ACTB、IL1B、IL6、IL8、IFNG、iNOS、TNF、TLR2、IL17A 和 NLRP3 等基因表达上调，但与 boMdM 不同的是，非 EV 分泌物也能诱导较高或相似的上调。而且，LTA 刺激对 PBMCs 中 IL1B、IL17A、INFG、iNOS、TNF 或 NLRP3 的表达以及 IL1B 蛋白的释放没有影响，只有在 SaEVs 刺激下，PBMCs 中 ILB1 的释放才会显著增加。
7. M5512B SaEVs 和非 EV 分泌物的蛋白质组分析：为了探究 boMdM 和 PBMCs 形态和基因表达变化的原因，研究人员对 SaEVs 和非 EV 分泌物进行了蛋白质组分析。结果发现，共鉴定出 655 种独特蛋白质，其中 555 种仅存在于 SaEVs 中，4 种仅存在于非 EV 分泌物中，96 种两者都有。在共享蛋白质中，77 种在 SaEVs 中更丰富，只有 6 种在非 EV 分泌物中更丰富。SaEVs 中蛋白质数量最多的类别与细胞和代谢过程相关，还鉴定出了与毒力、抗生素耐药性等相关的蛋白质簇。

综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。研究人员通过一系列实验，深入探讨了 SaEVs 对牛免疫细胞的影响。他们发现 SaEVs 能调节 boMdM 的免疫反应，引发促炎反应并倾向于启动细胞焦亡，而且 boMdM 和 PBMCs 对 SaEVs 的反应存在差异。蛋白质组分析揭示了 SaEVs 中含有与毒力和抗生素耐药性相关的蛋白质，这进一步说明了S. aureus可能利用 SaEVs 逃避宿主防御和在乳腺定植。这些发现为理解S. aureus感染的机制提供了新线索，也为未来开发针对S. aureus的疫苗奠定了基础。也许在不久的将来，科学家们就能根据这些研究成果，研发出更有效的疫苗，帮助养殖户们战胜乳腺炎这个 “大反派”，让奶牛们能健康产奶，养殖户们也能减少损失。