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为解决 RNAi 临床应用中溶酶体逃逸难、肿瘤靶向性差及无法穿越血脑屏障等问题，中国科学院生物物理研究所研究人员开展 tHFn (+) 纳米载体研究。结果显示其能高效递送 siRNA 治疗胶质瘤。推荐阅读，助力了解前沿肿瘤治疗策略。
在医学领域，RNA 干扰（RNAi）技术就像是一把神奇的 “基因剪刀”，它能够精准地剪断特定基因的表达链条，为肿瘤治疗带来了全新的希望。RNAi 技术的核心成员 —— 小干扰 RNA（siRNA），由 21 - 23 个碱基对组成的双链 RNA，能在细胞质中与 mRNA 紧密结合，让那些与肿瘤发生、发展相关的基因 “沉默”，从而抑制肿瘤的生长。但 siRNA 这把 “剪刀” 却有些 “脆弱”。它是亲水性的，就像一个怕水的孩子，无法自己穿过疏水的细胞膜进入细胞内部发挥作用；它的个头小，只有 7 - 8nm，分子量也仅有 13.3kDa，很容易被肾脏当作 “小杂质” 过滤掉；而且，当它好不容易进入细胞后，又常常被困在细胞内的 “垃圾处理站”—— 内体 / 溶酶体中，还没来得及 “工作” 就被降解了。
不仅如此，siRNA 还像一个没有导航的旅行者，在体内无法准确找到肿瘤的位置，这就大大限制了它在肿瘤治疗中的实际应用。为了解决这些难题，科研人员尝试了各种办法，他们开发了脂质纳米颗粒（LNPs）、基于 N - 乙酰半乳糖胺的纳米载体、聚合物、胶束、外泌体等多种递送系统，这些 “运输工具” 在一定程度上解决了 siRNA 的稳定性和递送效率问题，但它们的 “导航能力” 依旧不足，在肿瘤治疗时常常 “迷路”，导致治疗效果不尽如人意。
而在治疗胶质母细胞瘤（GBM）时，这个问题更加棘手。GBM 就像大脑中的 “恶魔”，异常凶险。siRNA 药物想要战胜它，必须先突破血脑屏障（BBB）这道坚固的防线。血脑屏障就像大脑的 “忠诚卫士”，只允许特定的物质进入大脑，这使得 siRNA 药物很难到达肿瘤部位发挥作用。所以，找到一种既能有效穿过血脑屏障，又能精准靶向 GBM 的载体，成为了肿瘤治疗领域亟待解决的难题。
为了攻克这一难关，中国科学院生物物理研究所的研究人员在《Science Advances》期刊上发表了一篇名为 “Engineered ferritin nanocarriers for efficient siRNA delivery across the blood-brain barrier to treat glioblastoma” 的论文。他们发现了一种天然的 “运输小能手”—— 铁蛋白（Ferritin）。铁蛋白在许多生物体内都存在，哺乳动物的铁蛋白有着独特的空心球形结构，而且它还能在 pH 值的调控下可逆地进行组装和解组装，这一特性让它成为了理想的药物载体 “候选人”。特别是人重组重链铁蛋白（HFn），它就像一个自带 “导航” 的快递员，能够特异性地识别并结合许多肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体 1（TfR1），还能穿越血脑屏障，把药物精准地送到胶质瘤细胞中。
研究人员想，如果能对铁蛋白进行改造，让它变得更强大，不就能解决 siRNA 的递送难题了吗？于是，他们通过基因工程技术，对 HFn 进行了一系列巧妙的改造，设计出了一系列带有正电荷空腔和截短羧基末端的铁蛋白变体 ——tHFn (+)。这个小小的改变，却让铁蛋白拥有了神奇的功能。
研究人员在实验过程中用到了多种关键技术方法。他们运用蛋白质结构分析技术，精心筛选出铁蛋白内部合适的突变位点，让铁蛋白内部带上正电荷，增强与 siRNA 的结合能力；利用冷冻电镜技术，高分辨率地解析 tHFn (+) 的蛋白质结构，从而深入了解它在弱酸性环境下的变化机制；借助细胞成像技术，比如共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），直观地观察 tHFn (+) 及其携带的 siRNA 在细胞内的行踪，包括它们与内体、溶酶体的共定位情况；还通过体内成像技术，如近红外荧光（NIRF）成像，追踪 tHFn (+) 在体内的分布和代谢情况。
下面来看看研究人员通过这些技术方法得到了哪些有趣的结果。
- tHFn (+) 变体的设计与表征：研究人员先对铁蛋白的内部结构进行了细致的分析，发现其中存在很多带负电荷的基团。就像在一个小房间里，有很多带负电的 “小磁铁”。他们通过理性设计，筛选出了 7 个带负电氨基酸的突变位点，用带正电的氨基酸进行替换，得到了 HFn (+)。为了进一步扩大内部空腔、优化界面相互作用，他们又设计了一系列截短的 HFn (+) 变体，像 tHFn (+)、tHFn(+)等等。这些变体在大肠杆菌中成功表达并经过多步纯化后，研究人员发现，tHFn (+)、tHFn(+)和 tHFn (+)无法正常组装成均匀的纳米笼，而 tHFn (+)、tHFn(+)和 tHFn (+)则能保持类似天然 HFn 的组装状态，并且它们的整体结构也没有受到太大影响，平均粒径与 HFn 相近，zeta 电位也表明突变和截短没有改变其表面电荷，这几个变体可以用于后续研究。
- tHFn (+) 变体的筛选及溶酶体逃逸机制：溶酶体逃逸是 RNAi 发展的关键瓶颈。研究人员以能否有效从溶酶体逃逸为标准，对 tHFn (+) 变体进行筛选。他们用 Cy5.5 标记不同的蛋白，将其与 U87MG 细胞孵育，然后通过 CLSM 观察它们与溶酶体的共定位情况，并计算皮尔逊相关系数（PCC）。结果发现，随着截短长度增加，PCC 值减小，tHFn (+)的 PCC 值小于 0.5，显示出显著的溶酶体逃逸能力，于是研究人员选择它作为最优的 siRNA 载体，并深入研究其逃逸机制。研究发现，tHFn (+) 在 pH 值为 6 时就开始解组装，而 HFn 要在 pH 值为 4 时才开始解组装。在弱酸性的内体环境（pH 6.0 - 6.5）中，tHFn (+) 解组装后会暴露内部的正电荷，这些正电荷就像 “小炸弹” 一样，破坏内体的结构，让包裹在其中的 siRNA 成功逃脱，避免被溶酶体降解，而 HFn 则倾向于继续进入溶酶体并在其中积累。
- siRNA 的封装及 siRNA@tHFn (+) 的表征：筛选出最优变体后，研究人员开始研究 tHFn (+) 的封装能力。他们通过 pH 介导的解组装 / 再组装策略制备了 siRNA@tHFn (+)，发现 tHFn (+) 系列对 siRNA 的封装能力比 HFn 更强，tHFn (+)的装载效率最高，每个铁蛋白纳米笼大约能装载 1.49 个 siRNA 分子。通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、zeta 电位分析和琼脂糖凝胶电泳（AGE）等技术对 siRNA@tHFn (+) 进行表征，结果表明 siRNA 成功装载在铁蛋白纳米笼内，且形成的纳米笼结构稳定。在体外稳定性实验中，siRNA@tHFn (+) 在含有 10% 血清的培养基中孵育 24 小时后，siRNA 的条带都没有明显变化，说明它能稳定存在。而且，通过实验证实了 siRNA@tHFn (+) 能够成功从溶酶体逃逸进入细胞质。
- siRNA@tHFn (+) 的细胞摄取和基因敲低效率：在体外实验中，研究人员用 Cy5 标记的 siRNA 和 siRNA@tHFn (+) 处理 U87MG 细胞，通过 CLSM 和流式细胞术观察发现，tHFn (+) 能显著增强细胞对 siRNA 的摄取。裸 siRNA 由于亲水性和不稳定性，很难穿过细胞膜，在 2 - 4 小时内逐渐被降解，而 siRNA@tHFn (+) 在 2 小时后就能大量进入细胞质，4 小时时完全被细胞摄取。研究人员还以端粒酶逆转录酶（TERT）和表皮生长因子受体（EGFR）为治疗靶点，这两个基因在胶质瘤的发展中都起着重要作用。实验结果显示，siRNA@tHFn (+) 能有效敲低 TERT 和 EGFR 的表达，并且呈现出剂量依赖性，而游离的 siRNA 和 tHFn (+) 对基因表达的影响较小。这表明 tHFn (+) 是一种通用的载体，能够搭载不同的 siRNA 实现基因沉默，在胶质瘤治疗方面展现出巨大的潜力。
- tHFn (+) 穿越血脑屏障的能力：研究人员通过 ELISA 和结构比对发现，tHFn (+) 与 HFn 对受体的结合亲和力相当，它们的外表面几乎相同，这意味着 tHFn (+) 也能像 HFn 一样结合受体。在体外的 Transwell 模型实验中，tHFn (+) 和 siRNA@tHFn (+) 能够像 HFn 一样有效地穿越模拟的血脑屏障，而 siRNA@LNP 则很难穿越。细胞毒性实验表明 tHFn (+) 对脑内皮细胞没有毒性，不会破坏血脑屏障。在体内实验中，tHFn (+) 和 siRNA@tHFn (+) 的血浆半衰期比游离 siRNA 长得多，并且能够在脑肿瘤部位积累，而游离 siRNA 和 siRNA@LNP 在脑内的信号很弱。这些结果充分证明了 tHFn (+) 能够有效穿越血脑屏障，到达肿瘤部位，是一种优秀的体内 siRNA 载体。
- siRNA@tHFn (+) 在原位胶质瘤模型中的体内治疗效果：研究人员在原位胶质瘤模型小鼠中进行了体内治疗实验。他们给小鼠静脉注射不同的制剂，发现 siTERT@tHFn (+) 能有效抑制胶质瘤的生长，肿瘤抑制率达到 78.9%，而 siTERT@LNP 由于无法穿越血脑屏障，在体内实验中没有显示出治疗效果。同样，siEGFR@tHFn (+) 也能显著抑制肿瘤生长，抑制率为 63.3%。通过 H&E 染色、WB、免疫荧光和流式细胞术等实验进一步证实，siRNA@tHFn (+) 能够有效抑制肿瘤生长，下调相关蛋白的表达，而且对小鼠的体重没有明显影响，说明其毒性较低。
- 生物安全性评估：为了评估 siRNA@tHFn (+) 的生物安全性，研究人员给健康小鼠注射了 PBS、tHFn (+)、siTERT@tHFn (+) 和 siEGFR@tHFn (+)，然后对小鼠的主要器官进行 H&E 染色、血常规检测以及肝肾功能评估。结果显示，与对照组相比，治疗组的小鼠主要器官没有明显的病理变化，血常规和肝肾功能指标也都正常，这表明 tHFn (+) 是一种生物相容性好、全身毒性低的载体。
综合这些研究结果，研究人员成功构建了一种极具潜力的 siRNA 载体 tHFn (+)。它就像一个精心打造的 “智能快递车”，不仅能够在弱酸性的内体环境中解组装，释放出 siRNA，避免被溶酶体降解，还能有效穿过血脑屏障，精准地将 siRNA 递送到脑肿瘤部位，实现高效的基因沉默，显著抑制胶质瘤的生长。与传统的 LNPs 相比，tHFn (+) 在体内的治疗效果更加显著，这主要得益于它能够成功穿越血脑屏障到达肿瘤部位。而且，tHFn (+) 源自天然物质，具有高生物相容性和低毒性的优点，大大降低了治疗过程中的风险。
tHFn (+) 纳米载体的出现，为 RNAi 疗法治疗各种肿瘤和遗传性疾病提供了一个强大的平台。它就像一把万能钥匙，能够打开肿瘤治疗的新大门，让我们在攻克癌症的道路上又迈出了坚实的一步。未来，随着研究的不断深入，tHFn (+) 有望在临床治疗中发挥更大的作用，为广大患者带来新的希望。
