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为解决人工甜味剂与心血管疾病关系及机制不明的问题，山东大学齐鲁医院等单位的研究人员开展阿斯巴甜与动脉粥样硬化的研究，发现阿斯巴甜通过胰岛素加重动脉粥样硬化。该研究为心血管疾病治疗提供新思路，值得科研读者一读。
在当今社会，为了减少糖分摄入，很多人选择食用添加了人工甜味剂（Artificial sweeteners，ASWs）的食品和饮料。人工甜味剂，也叫非营养性甜味剂，其中阿斯巴甜（Aspartame，APM）是常用的一种，它甜度高且几乎没有热量，受到不少消费者的青睐。然而，近年来越来越多的研究发现，人工甜味剂的摄入可能和心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVDs）存在关联。
一些研究指出，食用人工甜味剂可能会引发高血压、血管功能障碍、炎症、体重增加以及肠道微生物群紊乱等问题，这些都与心血管疾病风险增加相关 。但也有研究持不同观点，认为人工甜味剂对体重或葡萄糖稳态并无不良影响。所以，人工甜味剂与心血管疾病之间的关系仍存在争议，尤其是其背后的分子机制更是扑朔迷离。就拿阿斯巴甜来说，虽然已有研究表明它可能与肥胖、2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）、癌症、心血管疾病等多种疾病有关，但长期食用阿斯巴甜对健康的影响，还需要更深入的研究。
胰岛素抵抗和高胰岛素血症被认为是心血管疾病的风险因素，而且胰岛素抵抗还与动脉粥样硬化（Atherosclerosis）的发展有关，动脉粥样硬化可是心血管疾病、中风以及其他动脉功能障碍相关疾病的主要病因 。炎症在动脉粥样硬化的发生、发展过程中也起着重要作用，它与动脉壁脂质积累相伴而生。不过，胰岛素抵抗、高胰岛素血症与动脉粥样硬化之间的具体联系机制，目前还不清楚。
为了揭开这些谜团，山东大学齐鲁医院等单位的研究人员在《Cell Metabolism》期刊上发表了题为 “Sweetener aspartame aggravates atherosclerosis through insulin-triggered inflammation” 的论文。研究发现，阿斯巴甜会通过胰岛素引发炎症，进而加重动脉粥样硬化。这一发现为治疗与动脉粥样硬化相关的心血管疾病提供了新的方向。
研究人员为了开展这项研究，用到了多种技术方法。在动物实验方面，通过给小鼠和猴子喂食不同剂量的阿斯巴甜，观察其对胰岛素分泌、血糖水平和动脉粥样硬化的影响；还进行了双侧膈下迷走神经切断术（Bilateral subdiaphragmatic vagotomy，SDV），探究迷走神经在阿斯巴甜调节胰岛素分泌中的作用。在细胞实验层面，利用 RNA 测序（RNA-seq）技术分析胰岛素刺激下动脉内皮细胞的基因表达变化；运用荧光激活细胞分选（Fluorescence-activated cell sorting，FACS）分析来检测细胞表面分子的表达；采用单细胞 RNA 测序（Single cell-RNA sequencing，scRNA-seq）对不同细胞群体进行分类和分析 。这些技术方法相互配合，为研究提供了有力支持。
下面我们来详细看看研究结果。
APM 加重小鼠动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是导致心血管疾病的关键病理过程，而食用人工甜味剂与心血管疾病的高发病率有关。为了探究阿斯巴甜与动脉粥样硬化之间的关系，研究人员给 ApoE 基因敲除（ApoE??）小鼠喂食不同剂量的阿斯巴甜。12 周后发现，与对照组相比，喂食阿斯巴甜的小鼠主动脉中动脉粥样硬化斑块（Atherosclerotic plaques，APs）明显增加，而且从 0.05% 到 0.15%（w/w）呈现出剂量依赖性。无论是雄性还是雌性小鼠，都出现了这种情况 。研究人员还通过 H&E 染色、油红 O 染色、天狼星红染色以及免疫荧光分析等方法，进一步验证了阿斯巴甜会促进斑块生长和不稳定。另外，时间进程实验表明，随着喂食阿斯巴甜时间的延长，斑块会不断增大。而且，与喂食 15% 蔗糖的小鼠相比，阿斯巴甜促进动脉粥样硬化的效果更明显 。
APM 增加血浆胰岛素水平和迷走神经依赖性胰岛素调节
研究人员想知道阿斯巴甜对血浆胰岛素和循环葡萄糖水平有什么影响。他们通过让小鼠舔食涂抹在爪子上的阿斯巴甜溶液，确保小鼠摄入足够的阿斯巴甜。结果发现，喂食 0.05%、0.1% 和 0.15% 阿斯巴甜 10 分钟后，小鼠在 30 分钟时血浆胰岛素水平显著升高，持续喂食 0.15% 阿斯巴甜 12 周后，小鼠血清胰岛素水平持续升高，并且出现了胰岛素抵抗 。在食蟹猴实验中，给猴子喂食 0.15% 阿斯巴甜或 15% 蔗糖 10 分钟后，30 分钟时两组猴子的胰岛素水平都出现了暂时升高，不过阿斯巴甜组和蔗糖组的血清胰岛素水平几乎没有差异，但两组的血糖水平却呈现出相反的变化趋势。此外，切断小鼠的双侧膈下迷走神经后，阿斯巴甜诱导的胰岛素分泌和动脉粥样硬化都被抑制了，这表明迷走神经激活对阿斯巴甜诱导的胰岛素产生和动脉粥样硬化至关重要 。
胰岛素依赖型动脉粥样硬化的机制研究
为了进一步研究胰岛素对动脉粥样硬化的影响，研究人员采用了功能获得和功能缺失两种实验方法。他们给 ApoE??小鼠皮下植入能缓慢释放外源性胰岛素的微型渗透泵，模拟人体内高于内源性水平的循环胰岛素水平（1.5 ng/mL，相当于 25 mIU/mL） 。结果发现，这会使小鼠的动脉粥样硬化斑块形成、生长和不稳定性明显加重，类似于喂食阿斯巴甜导致的结果。相反，使用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）抑制胰腺胰岛素的产生后，阿斯巴甜加重的动脉粥样硬化斑块形成、生长和不稳定性都被完全中和了 。这两个实验证明，胰岛素上调是阿斯巴甜加重动脉粥样硬化的必要条件。
鉴定 CX3CL1 为胰岛素刺激的动脉内皮趋化因子
内皮细胞损伤和动脉壁功能障碍是动脉粥样硬化病变形成的初始触发因素。研究人员分离出野生型 C57BL/6J 小鼠的原代主动脉内皮细胞（Primary aortic endothelial cells，PAECs），并用胰岛素进行刺激 。8 小时后进行 mRNA 测序分析，发现胰岛素刺激的 PAECs 中趋化因子 CX3CL1 的表达显著上调，是所有基因中上调最明显的 。qPCR 和蛋白质免疫印迹实验也证实了这一结果。在体内实验中，研究人员发现喂食阿斯巴甜的小鼠循环 CX3CL1 蛋白水平明显高于对照组，而且主动脉内皮细胞表面的 CX3CL1 信号也更强 。这表明阿斯巴甜能在体内增加循环和内皮细胞膜结合的 CX3CL1 水平。
CX3CL1 - CX3CR1 对单核细胞 / 巨噬细胞的趋化和黏附作用
CX3CL1 专门与其受体 CX3CR1 结合，介导炎症和免疫细胞的趋化和黏附。研究人员假设 CX3CL1 - CX3CR1 轴是巨噬细胞迁移、黏附和 M1 极化的趋化信号通路 。他们用短发夹 RNA（shRNA）敲低 RAW264.7 单核细胞中 CX3CR1 的表达，然后利用平行板流动室模拟动脉血管中的剪切应力，观察单核细胞与内皮细胞的黏附情况 。结果发现，胰岛素刺激的 PAECs 能显著增强单核细胞的黏附，而敲低 CX3CR1 后这种黏附作用几乎完全被抑制。此外，激活 CX3CL1 - CX3CR1 信号还能诱导单核细胞迁移，并促进 M0 巨噬细胞向 M1 巨噬细胞极化，使这些细胞表达更多的促炎细胞因子 。
Cx3cr1 基因缺失减轻促炎髓细胞群体
为了验证 CX3CL1 - CX3CR1 信号在介导阿斯巴甜促动脉粥样硬化作用中的作用，研究人员采用基因功能缺失的方法，在单核细胞和巨噬细胞中特异性删除 Cx3cr1 基因 。他们通过单细胞 RNA 测序分析了 Cx3cr1 基因敲除小鼠和野生型小鼠外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的群体变化。结果发现，Cx3cr1 基因敲除小鼠的髓细胞群体明显减少，其中 Mono - c1 亚群显著降低，而 Mono - c3 和 Macro - c5 亚群则有所增加 。这表明 CX3CL1 - CX3CR1 信号轴在调节髓细胞的组成和功能方面起着关键作用。
Cx3cr1 基因缺失中和 APM 加重的动脉粥样硬化
研究人员进一步研究了不同单核细胞 / 巨噬细胞在 Cx3cr1 基因敲除小鼠和野生型小鼠中的功能 。基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析显示，Mono - c1、Mono - c4 和 Macro - c6 具有促炎特征，而 Mono - c2、Mono - c3 和 Macro - c5 则表现出抗炎特性 。将 Cx3cr1 基因敲除小鼠与 ApoE??小鼠杂交产生双敲除小鼠后发现，阿斯巴甜加重的动脉粥样硬化斑块形成和生长在双敲除小鼠中被完全中和了 。这说明 CX3CL1 - CX3CR1 信号通过巨噬细胞与内皮细胞的相互作用，介导了阿斯巴甜引发的动脉粥样硬化斑块加重。
综合上述研究，研究人员得出结论：阿斯巴甜可通过激活迷走神经增加胰岛素分泌，进而上调内皮细胞膜结合的炎症趋化因子 CX3CL1，CX3CL1 与单核细胞 / 巨噬细胞表面的受体 CX3CR1 结合，促进单核细胞 / 巨噬细胞的黏附、迁移和 M1 极化，最终加重动脉粥样硬化 。
这项研究意义重大。它揭示了阿斯巴甜与动脉粥样硬化之间的新机制，为人工甜味剂与心血管疾病的关系提供了重要线索。同时，研究发现的胰岛素 - CX3CL1 - CX3CR1 信号轴，为治疗与动脉粥样硬化相关的心血管疾病和中风等疾病提供了新的治疗靶点 。不过，研究也存在一些局限性。比如，阿斯巴甜不能代表所有的人工甜味剂；ApoE??小鼠模型与人类动脉粥样硬化的发病和发展可能不完全相关；虽然使用了猴子模型，但还需要更严谨的临床研究来确定研究结果与人类的相关性；在猴子模型中，没有研究阿斯巴甜对动脉粥样硬化的影响；而且根据现有数据，不能排除其他独立于甜味受体（Sweet taste receptors，STRs）的机制 。但这并不影响这项研究的价值，它为后续研究指明了方向，期待未来能有更多的研究来进一步完善我们对人工甜味剂与健康关系的认识。
