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为解决胰腺癌（PDAC）治疗难题，台北医学大学的研究人员开展 hsa_circ_0004781 在 PDAC 中作用的研究，发现其促癌作用及相关机制。这为 PDAC 治疗提供新靶点，极具科研价值，推荐科研读者一读。
在医学研究的广阔领域中，胰腺癌一直是一块难啃的 “硬骨头”。胰腺导管腺癌（PDAC）作为胰腺癌中最常见的类型，十分 “嚣张跋扈”，它是一种极具侵袭性的实体肿瘤。由于早期诊断困难，很多患者在发现时病情已经进展到了中晚期；而且它还具有高遗传异质性，每个患者的肿瘤细胞都可能有不同的基因变化；再加上对多种药物存在耐药性，这些因素加起来，使得 PDAC 患者的 5 年生存率低得可怜，只有大约 5 - 7%。这就像一座沉重的大山，压在患者和医学研究者的心头。
为了找到攻克 PDAC 的新方法，众多科研人员在各个方向上不断探索。近年来，一种名为环状 RNA（circRNA）的分子进入了大家的视线。circRNA 是由前体 mRNA（pre - mRNA）经过特殊的反向剪接过程形成的，它就像一条首尾相连的 “魔法环”，拥有独特的封闭环状结构。这个结构让它比普通的线性 mRNA 更加稳定，能够抵抗 RNase R 的降解。而且 circRNA 具有多种神奇的生物学功能，它可以像 “海绵” 一样吸附微小 RNA（miRNA），从而调节 miRNA 靶 mRNA 的表达；还能与蛋白质结合，影响蛋白质的活性和定位等。越来越多的研究发现，circRNA 与各种疾病都有着千丝万缕的联系，在肿瘤的发生、发展和耐药过程中，也发挥着至关重要的作用。在 PDAC 的研究中，已经有不少 circRNA 被发现参与其中，比如 hsa_circ_0007590、hsa_circ_0000919 等，它们通过不同的机制促进了 PDAC 的发展。但对于 circRNA 在 PDAC 中的作用机制，还有很多未知等待着科学家们去揭开。
在这样的背景下，来自台北医学大学癌症生物学与药物发现研究所的研究人员决心深入探索 circRNA 与 PDAC 之间的奥秘。他们的研究成果发表在了《Cancer Cell International》期刊上，论文题目是 “Real hsa_circ_0004781 promotes the proliferation of pancreatic ductal adenocarcinoma cells through the miR - 9 - 5p/KLF5 and miR - 338 - 3p/ADAM17 axes”。通过一系列严谨的实验，他们发现 hsa_circ_0004781 在 PDAC 中高表达，并且像一个 “帮凶” 一样，通过 miR - 9 - 5p/KLF5 和 miR - 338 - 3p/ADAM17 轴，促进了 PDAC 细胞的增殖和迁移。这一发现为 PDAC 的治疗提供了新的潜在靶点，就像在黑暗中为研究者们点亮了一盏明灯，为攻克 PDAC 带来了新的希望。
研究人员在探索过程中，运用了多种关键技术方法。他们借助公共数据库和生物信息学工具，像拿着 “探测器” 一样，筛选出在 PDAC 中高表达的 hsa_circ_0004781，并预测它潜在的 miRNA 靶点和相应的 mRNA 靶点。通过体外转录技术，利用核酶和离子对反相高效液相色谱（IP - RP HPLC），制备出与天然形式完全相同、没有任何外源序列的真实 hsa_circ_0004781。同时，采用功能缺失和功能获得实验，也就是通过敲低或过表达 hsa_circ_0004781，来观察它对 PDAC 细胞的影响。还运用了荧光素酶报告基因实验、细胞活力检测、伤口愈合实验、蛋白质免疫印迹分析、逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）、定量 PCR（qPCR）等技术，从不同角度对细胞的增殖、迁移、相关基因和蛋白的表达等进行检测和分析。
下面来看看具体的研究结果。
1. PDAC 细胞中 hsa_circ_0004781 的鉴定
研究人员首先利用 GSE79634 和 GSE69362 数据库，像在大海里捞针一样，筛选出在 PDAC 细胞中高表达的 circRNA，最终锁定了 hsa_circ_0004781。它由 PCNX1 基因的外显子 2 - 5 反向剪接而成，长度约为 451 个核苷酸。通过 RT - PCR 实验，在 AsPC - 1 和 BxPC - 3 这两种 PDAC 细胞系中都检测到了 hsa_circ_0004781 的表达。而且，经过 Sanger 测序确认，它确实是通过反向剪接形成的，并且和 PCNX1 mRNA 不同，hsa_circ_0004781 能够抵抗 RNase R 的降解，这就证明了它具有稳定的环状结构。
2. hsa_circ_0004781 促进 PDAC 细胞的增殖和迁移
为了探究 hsa_circ_0004781 在 PDAC 细胞中的具体作用，研究人员设计了针对它的 siRNA（si - c4781）。当把 si - c4781 转染到 AsPC - 1 和 BxPC - 3 细胞中后，hsa_circ_0004781 的表达明显降低，同时细胞的增殖能力也受到了显著抑制。相反，研究人员构建了能够过表达 hsa_circ_0004781 的质粒 pcDNA - ZKSCAN - c4781，将其转染到细胞中后，hsa_circ_0004781 的表达增加，细胞增殖也变得更加活跃。在伤口愈合实验中，敲低 hsa_circ_0004781 会抑制 AsPC - 1 细胞的迁移，而过表达它则会促进细胞迁移。此外，研究还发现，hsa_circ_0004781 能够调节细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）和上皮 - 间质转化（EMT）相关基因的表达，这些结果都表明 hsa_circ_0004781 在 PDAC 细胞中就像一个 “助推器”，促进了细胞的增殖和迁移，是一个具有癌基因特性的分子。
3. hsa_circ_0004781 作为 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 的海绵
研究人员通过生物信息学预测发现，hsa_circ_0004781 可能与 miRNA 存在相互作用。经过进一步筛选，发现 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 在 PDAC 中异常下调，并且它们很可能是 hsa_circ_0004781 的潜在靶点。当敲低 hsa_circ_0004781 后，miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 的表达显著增加，这表明 hsa_circ_0004781 就像一块 “海绵”，能够吸附 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p。为了进一步验证，研究人员构建了荧光素酶报告基因载体 pmirGLO - c4781，实验结果显示，miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 模拟物能够显著降低荧光素酶活性，说明它们确实可以与 hsa_circ_0004781 结合。而且，转染 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 模拟物会抑制 PDAC 细胞的增殖，这就表明 hsa_circ_0004781 通过吸附这两种 miRNA，促进了细胞的增殖。
4. hsa_circ_0004781 上调 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 靶基因的表达
研究人员接着利用多个数据库预测了 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 的潜在靶基因，经过筛选确定了几个关键的靶基因，如 KLF5、ADAM17 等。敲低 hsa_circ_0004781 会降低这些靶基因的表达，而过表达 hsa_circ_0004781 则会使它们的表达增加。当同时转染 hsa_circ_0004781 过表达质粒和 miR - 9 - 5p 或 miR - 338 - 3p 模拟物时，miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 能够逆转 hsa_circ_0004781 对靶基因的上调作用。这说明 hsa_circ_0004781 可以通过 miR - 9 - 5p/KLF5 和 miR - 338 - 3p/ADAM17 轴，调节这些靶基因的表达。
5. KLF5 和 ADAM17 分别是 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 的关键靶点
通过对 PDAC 患者生存数据的分析，研究人员发现，在众多靶基因中，只有 KLF5 和 ADAM17 与患者的生存情况呈负相关。这意味着它们在肿瘤的发展过程中起着至关重要的作用。进一步实验表明，miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 模拟物能够降低 KLF5 和 ADAM17 的蛋白质水平，而它们的抑制剂则会使蛋白质水平升高。这再次证实了 hsa_circ_0004781/miR - 9 - 5p/KLF5 和 hsa_circ_0004781/miR - 338 - 3p/ADAM17 轴在 PDAC 进展中的关键作用。
6. 核酶生成真实 hsa_circ_0004781 及 IP - RP HPLC 纯化
为了验证之前实验的结果，研究人员利用四膜虫（Tetrahymena）I 型内含子核酶，在体外成功生成了真实的 hsa_circ_0004781。这种真实的 hsa_circ_0004781 与天然形式完全相同，没有任何外源序列。通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（denaturing urea - PAGE）和 IP - RP HPLC 技术，对生成的产物进行检测和纯化，最终获得了高纯度的真实 hsa_circ_0004781，为后续实验提供了可靠的材料。
7. 真实 hsa_circ_0004781 对相关分子表达的影响
将真实的 hsa_circ_0004781 转染到 AsPC - 1 细胞中后，研究人员发现，它能够显著促进细胞的增殖，同时下调 miR - 9 - 5p 和 miR - 338 - 3p 的表达，上调 KLF5 和 ADAM17 的 mRNA 表达。这一结果再次确认了 hsa_circ_0004781 通过 miR - 9 - 5p/KLF5 和 miR - 338 - 3p/ADAM17 轴发挥促癌作用的结论。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：hsa_circ_0004781 在 PDAC 中高表达，并且通过 miR - 9 - 5p/KLF5 和 miR - 338 - 3p/ADAM17 轴，积极地推动了 PDAC 细胞的增殖和迁移，它很有可能成为治疗 PDAC 的一个重要靶点。在讨论部分，研究人员还提到，虽然 circRNA 在肿瘤研究中备受关注，但目前对于它的调控机制还有很多不清楚的地方。他们在研究过程中也发现，传统的 circRNA 表达质粒存在一些问题，比如会产生一些不确定的转录产物，影响实验结果的准确性。而他们制备真实 circRNA 的方法虽然成功验证了关键结论，但也存在一定的局限性，circRNA 的形成效率会受到多种因素的影响。不过，这项研究仍然具有重要意义，它为 PDAC 的治疗开辟了新的方向。未来，科学家们可以基于这一发现，进一步探索以 hsa_circ_0004781 为靶点的治疗策略，也许在不久的将来，就能为 PDAC 患者带来新的希望，帮助他们战胜这一可怕的疾病。
