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为解决外泌体生产、稳定性、安全性及疗效相关问题，泰国朱拉隆功大学研究人员开展用微载体 3D 培养系统生产 cEXO 的研究。结果显示 cEXO 有抗炎活性、稳定性和安全性。推荐科研读者阅读，助于了解外泌体在兽医领域的应用潜力。
在医学领域，外泌体（exosomes，是一种直径在 30 - 150nm 的小细胞外囊泡，能在细胞间传递分子信号 ，参与细胞间通讯 ）的研究热度一直居高不下。间充质干细胞（MSCs，具有强大的免疫调节和抗炎特性 ）来源的外泌体，更是被视为治疗多种疾病的 “潜力股”，尤其是在炎症性疾病的治疗方面，展现出了巨大的潜力。在众多 MSCs 中，脂肪来源的间充质干细胞（AD - MSCs）因其来源丰富、易于分离和强大的再生能力脱颖而出，成为了外泌体研究的热门 “原材料”。
传统的二维（2D）培养方式在生产 AD - MSCs 来源的外泌体时，就像在平坦的操场上活动，空间有限，无法模拟体内复杂的细胞微环境，导致外泌体的产量和功能都受到了限制。而三维（3D）培养技术则像是为细胞打造了一个立体的 “豪华城堡”，能更好地复制组织样结构，让外泌体拥有更强的生物活性。但是，3D 培养也不是十全十美的，它在生产抗炎外泌体时，需要优化培养条件来维持细胞的活力、增殖能力和分化潜能，而且外泌体的分离过程也需要严格的纯化步骤，否则很容易受到污染，影响其生物活性。
此外，外泌体要想真正应用于临床治疗，还得跨过稳定性、疗效和安全性这几道 “大关”。不同的储存条件对外泌体的结构完整性和生物活性影响很大，虽然外泌体有着天然的来源和低免疫原性的优势，但也存在着污染、脱靶效应和长期免疫反应等潜在风险，需要进行深入研究。
为了解决这些问题，来自泰国朱拉隆功大学兽医学院小动物教学医院的研究人员在《BMC Veterinary Research》期刊上发表了一篇名为 “Microcarrier-based three-dimensional culture system for production of anti-inflammatory exosomes from canine adipose-derived mesenchymal stem cells: yield, stability, safety, and efficacy evaluation” 的论文。他们通过一系列实验，探索了基于微载体的 3D 培养系统生产外泌体（cEXO）的可行性，并对 cEXO 的产量、稳定性、安全性和疗效进行了全面评估。这一研究成果为外泌体在兽医再生医学中的应用提供了重要的理论支持和实践依据。
研究人员在这项研究中，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细胞培养技术，从犬的脂肪组织中分离出 cAD - MSCs，并在 3D 环境中利用微载体进行培养；其次是外泌体的分离与鉴定技术，通过一系列处理从培养的细胞中获取外泌体，并利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）等多种技术对其进行表征；还有细胞功能检测技术，利用 LPS 诱导 RAW264.7 巨噬细胞炎症模型，检测 cEXO 的抗炎活性，同时对 3T3 - J2 成纤维细胞进行 cEXO 的细胞毒性检测；最后是动物实验技术，按照 ISO 10993 - 11 标准对大鼠进行急性毒性实验，评估 cEXO 的体内安全性。
下面我们来详细看看研究结果：
- 基于微载体的 3D 培养促进 cAD - MSCs 外泌体的规模化生产：研究人员搭建了基于微载体的 3D 培养系统来生产外泌体，从犬的脂肪组织中分离出 cAD - MSCs，让它们在聚苯乙烯（PS）微载体上生长。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，在细胞接种阶段，经过 3 小时的间歇搅拌，细胞开始附着在微载体上，呈现出圆形形态；随后 21 小时的静置期，细胞牢固附着，绿色荧光增强，说明细胞活力良好。在 3 天的扩增阶段，细胞增殖明显。但在第 1 天更换无血清培养基（0% FBS 培养基；VSCBIC - 3）收集外泌体时，细胞活力下降，出现圆形细胞和红色荧光增多的现象，这意味着细胞压力增大甚至死亡。不过，在第 3 天用 DMEM - 10FBS 培养基进行 2 天的补充培养后，细胞活力又得到了恢复。到第 4 天再次进行无血清培养基培养时，细胞活力进一步下降。通过对钙黄绿素荧光强度的定量分析，也证实了这些细胞活力变化的趋势。这表明在反复收集外泌体的过程中，维持细胞活力是个大挑战，也为优化 3D 培养系统指明了方向。
- 3D 培养的 cAD - MSCs 产生的外泌体（cEXO）的表征：对 cEXO 进行全面 “体检” 后发现，它的各项指标都很有潜力。透射电子显微镜（TEM）下，cEXO 呈现出典型的杯状形态；纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示其平均粒径约为 81.23±7.9nm，在正常外泌体范围内；Zeta 电位分析表明其表面带负电，为 - 19.45±0.85mV ，具有适度的胶体稳定性，这对外泌体在治疗中的应用非常有利；流式细胞术分析外泌体表面标记 CD9，证实了这些颗粒确实是外泌体。而且，NTA 检测到 cEXO 的浓度高达约 1.32±0.49×10?个颗粒 /mL ，蛋白质浓度为 45.6±18.42μg/mL，通过计算颗粒与蛋白质的比例，还能评估其纯度。
- 冷冻储存条件保持颗粒完整性并维持 cEXO 的稳定性：研究人员把 cEXO 分别放在 - 20°C 和 4°C 的环境下储存 30 天，看看会发生什么变化。结果发现，在 - 20°C 时，颗粒大小在第 15 天显著增加，之后趋于稳定；颗粒浓度则没有明显变化，说明虽然颗粒的大小发生了改变，但数量基本保持不变。而在 4°C 时，颗粒大小和浓度都发生了显著变化，颗粒大小持续增加，浓度却明显下降。此外，研究还发现， - 20°C 时颗粒的 zeta 电位显著降低，这可能会影响外泌体的细胞摄取和功能；4°C 虽然在维持颗粒大小和 zeta 电位的稳定性方面表现更好，但会导致颗粒浓度下降，说明长期冷藏可能会使外泌体降解。这表明不同的储存温度对外泌体的稳定性影响很大，需要找到更合适的储存条件来保持外泌体的完整性和功能。
- cEXO 在 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞模型中发挥抗炎潜力：在这个实验中，研究人员用脂多糖（LPS）诱导 RAW264.7 巨噬细胞产生炎症，然后分别用 PBS（作为空白对照）、地塞米松（DEXA，一种阳性抗炎对照药物）和不同浓度的 cEXO 进行处理。通过显微镜观察发现，不同处理组的巨噬细胞形态发生了明显变化。PBS 处理的巨噬细胞在 LPS 存在时呈现出典型的促炎 M1 型大变形虫状，而 DEXA 和 cEXO 处理的巨噬细胞则更趋向于抗炎的 M2 型，表现为更紧凑、圆形的形态，而且 cEXO 浓度越高，这种变化越明显。细胞毒性分析显示，cEXO 处理对巨噬细胞的活力没有显著影响，细胞活力始终保持在 80% 以上。在抗炎实验中，cEXO 表现出了反向剂量依赖性的抗炎效果，即较低浓度的 cEXO（10?个颗粒 /mL）抑制一氧化氮（NO）释放的效果最好，达到了 33.93±10.86% ，高于较高浓度的 cEXO，这表明 cEXO 具有显著的抗炎潜力，且不会对细胞产生毒性。
- cEXO 对 3T3 - J2 成纤维细胞无细胞毒性：研究人员用不同浓度的 cEXO 处理 3T3 - J2 成纤维细胞，然后通过刃天青（resazurin）实验检测细胞活力。结果发现，与 PBS 对照组相比，cEXO 处理后的成纤维细胞活力基本保持不变，即使在高浓度的 cEXO 处理下，细胞活力也没有明显下降。这说明 cEXO 对成纤维细胞的细胞毒性极小，具有良好的生物相容性，为其在治疗中的应用提供了安全保障。
- 在啮齿动物模型中证明 cEXO 的急性毒性安全性（ISO 10993 - 11）：研究人员按照国际标准，给 5 只雌性 Sprague - Dawley 大鼠通过尾静脉注射 cEXO（10?个颗粒 /mL），然后进行了为期 14 天的观察。在整个实验过程中，没有大鼠死亡或出现明显的疾病症状，它们的行为、运动都很正常，也没有出现震颤、抽搐、嗜睡等异常表现。在饮食方面，大鼠的食物和水摄入量都保持稳定，体重也呈现出正常的增长趋势，这说明 cEXO 对大鼠的食欲和整体健康没有不良影响。实验结束后，对大鼠进行解剖检查，发现主要器官，如肝脏、肾脏、脾脏等都没有出现异常，进一步证实了 cEXO 的安全性。
研究结论表明，基于微载体的 3D 培养系统能够有效地生产 cEXO，这种外泌体具有稳定的物理化学性质、低细胞毒性和显著的抗炎潜力，在冷冻条件下储存时能更好地保持完整性和功能。而且，急性毒性实验也证明了 cEXO 在体内的安全性。这些结果为 cEXO 在兽医炎症性疾病和再生医学中的应用提供了有力支持，有望为兽医临床治疗带来新的突破。
不过，研究人员也很清醒地认识到了这项研究存在的一些局限性。比如，在表征外泌体时，虽然用了 CD9 作为标记，但按照相关指南，还应该加入 CD63、CD81 等更多标记来确认外泌体的纯度，排除其他细胞外囊泡的污染；研究中使用的 cAD - MSCs 来自有限的供体，样本量较小，可能会影响研究结果的可重复性和普遍性；此外，目前只研究了冷冻和冷藏条件下 cEXO 的稳定性，未来还需要探索在室温下的悬浮配方，比如添加海藻糖或聚乙二醇（PEG）等稳定剂，让外泌体在临床应用中更加方便，尤其是在资源有限的地区。
总的来说，这项研究为外泌体的研究和应用开辟了新的道路，虽然还有一些需要改进的地方，但它的重要意义不可忽视。相信在未来，随着研究的不断深入，外泌体在医学领域，特别是兽医再生医学中的应用会越来越广泛，为更多动物的健康带来希望。
