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为解决 BRAFV600E突变的结直肠癌（CRC）治疗难题，浙江大学医学院附属邵逸夫医院等单位的研究人员开展基于细胞外囊泡（EVs）和核酸药物治疗 CRC 的研究，发现 EVs-siBRAFV600E能抑制肿瘤，为 CRC 治疗提供新策略，值得一读。
在癌症的世界里，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一个常见且棘手的 “敌人”。它不仅发病率高，还是个 “多面手”，具有明显的异质性，不同亚型的 CRC 有着各自独特的基因突变特征。在众多突变中，BRAF 基因突变的出现，让情况变得更加复杂。大约 10 - 20% 的 CRC 患者体内存在 BRAF 基因突变，其中 BRAFV600E突变尤为突出。这个突变就像是癌细胞的 “加速键”，它会显著增强 BRAF 基因编码产物的活性，让癌细胞像脱缰的野马一样，在没有外界刺激的情况下，疯狂地增殖，进而促进肿瘤的发展和转移。
对于携带 BRAFV600E突变的 CRC 患者来说，目前的治疗手段效果并不理想。传统的化疗药物，如 5 - FU、伊立替康和奥沙利铂，对这类患者的疗效十分有限。接受一线化疗的患者，中位生存时间仅约 11 个月，而针对 BRAF 突变开发的 BRAF 抑制剂，如维莫非尼和恩考芬尼，单药治疗的效果也差强人意。维莫非尼治疗 BRAF 突变 CRC 患者的缓解率只有 4.8%，恩考芬尼治疗晚期 BRAFV600E CRC 患者时，甚至没有观察到完全或部分缓解的病例。这些抑制剂疗效不佳的原因在于，它们只能暂时抑制关键激酶 MEK1/2 的磷酸化，随后还会导致表皮生长因子受体（EGFR）的快速反馈激活，使得 BRAF 抑制剂的作用被绕过。由此可见，寻找新的治疗策略迫在眉睫。
为了攻克这一难题，浙江大学医学院附属邵逸夫医院等单位的研究人员进行了深入探索，并在相关领域取得了重要成果。他们的研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上，论文题目为《Engineered extracellular vesicles loaded with BRAFV600E siRNA for the treatment of BRAFV600E-mutant colorectal cancer》 。研究人员构建了一种基于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）和核酸药物的治疗系统，用于治疗 BRAFV600E突变的结直肠癌。该研究表明，这种治疗系统能够特异性地抑制 BRAFV600E CRC 细胞的生长和转移，为这类癌症的治疗带来了新的希望，也为其他携带 BRAFV600E突变肿瘤的治疗提供了潜在的方向，在基础研究和临床转化方面都具有重要意义。
在这项研究中，研究人员使用了多种技术方法。首先，他们通过构建 shRNA 慢病毒载体并转染细胞，获得了能稳定产生携带 BRAFV600E核酸药物（siBRAFV600E）的工程细胞，进而得到治疗用的 EVs - siBRAFV600E 。接着，运用 RNA 提取和定量实时 PCR（qRT - PCR）技术，检测细胞和细胞外囊泡中的 RNA 水平；采用蛋白质免疫印迹（Western blotting，WB）技术，分析相关蛋白的表达和磷酸化水平。此外，还利用细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8）检测细胞活力，划痕实验评估细胞迁移能力，EdU 实验检测细胞增殖活性，流式细胞术分析细胞凋亡情况。在动物实验方面，构建了多种动物模型，包括皮下移植瘤模型、转移模型以及患者来源的异种移植（PDX）模型，以此来评估治疗效果和机制。
研究人员首先利用公共数据库和临床标本，探索了 BRAF 突变与 CRC 患者预后的关系。通过分析 cBioPortal 数据库中肠肿瘤患者的生存数据，发现 BRAF 突变患者的中位总生存期明显短于 BRAF 野生型患者。在对 TCGA 数据库中结肠癌患者进行多因素 Cox 比例风险回归分析时，也证实了 BRAF 突变和 IV 期是不良预后因素。进一步研究发现，在 BRAF 突变的结肠癌患者中，高 BRAF mRNA 水平与较短的无复发生存期相关。对临床标本的免疫组化分析表明，BRAFV600E患者的 KI67 阳性率更高。综合这些分析，研究人员得出结论：BRAF 突变是 CRC 患者的不良预后因素。
为了构建针对 BRAFV600E突变的治疗药物，研究人员以特定的 siRNA 序列（siBRAFV600E）为 “武器”，构建了 shRNA 慢病毒载体。通过实验发现，该序列能特异性降低 BRAFV600E突变的 RKO 细胞中 BRAF mRNA 水平，而对野生型的 COLO320 细胞无明显影响。研究人员用携带 siBRAFV600E的慢病毒感染 HEK293T 细胞，获得了稳定产生治疗性细胞外囊泡（EVs - siBRAFV600E）的工程细胞。对这些细胞外囊泡进行表征分析发现，它们具有相似的粒径、典型的盘状或杯状形态，且均表达细胞外囊泡标记分子。RKO 细胞能够摄取 EVs - siBRAFV600E ，并且该治疗性细胞外囊泡能有效降低 RKO 细胞中的 BRAF 水平，而对 COLO320 细胞的 BRAF 水平无显著影响。这表明研究人员成功构建了能携带靶向 BRAFV600E突变 siRNA 的治疗性细胞外囊泡，且该囊泡不会影响 BRAF 野生型结肠癌细胞的 BRAF 水平。
在体外实验中，研究人员选用了 BRAFV600E突变的 CRC 细胞系 RKO 和 HT29。EdU 实验、CCK - 8 实验和集落形成实验结果显示，与对照组相比，EVs - siBRAFV600E处理后的 RKO 和 HT29 细胞增殖活性显著降低。流式细胞术分析表明，EVs - siBRAFV600E能显著诱导细胞凋亡。伤口愈合实验发现，EVs - siBRAFV600E处理后，RKO 细胞的迁移能力明显下降。这些结果表明，EVs - siBRAFV600E在体外能显著抑制 BRAFV600E突变的 CRC 细胞的增殖、迁移，并促进其凋亡。
为了验证治疗性细胞外囊泡的特异性，研究人员选用了 BRAF 野生型的结直肠癌细胞系 COLO320 和 HCT116 进行实验。CCK - 8 实验、EdU 实验和集落形成实验结果表明，EVs - siBRAFV600E对 COLO320 和 HCT116 细胞的增殖没有抑制作用。流式细胞术分析和伤口愈合实验显示，EVs - siBRAFV600E不会诱导细胞凋亡，也不会降低细胞的迁移能力。这说明 EVs - siBRAFV600E对 BRAF 野生型结直肠癌细胞的行为没有显著影响，具有针对 BRAFV600E突变的特异性干扰作用。
研究人员进一步探究了治疗药物的作用机制。qRT - PCR 和 Western blotting 实验结果显示，在 BRAFV600E突变的 RKO 和 HT29 细胞中，EVs - siBRAFV600E处理后，BRAF 的 mRNA 和蛋白质水平显著降低，MEK1/2 和 ERK1/2 的磷酸化水平也明显下降。而在 BRAF 野生型的 COLO320 和 HCT116 细胞中，EVs - siBRAFV600E处理后，这些指标均无显著变化。这表明 EVs - siBRAFV600E通过抑制 BRAF - MEK1/2 - ERK1/2 信号通路，发挥对 BRAFV600E突变 CRC 细胞的抑制作用，且对 BRAF 野生型细胞无明显影响。
在体内实验中，研究人员构建了 BALB/c 裸鼠的 CRC 皮下移植瘤模型和肺、肝转移模型。结果显示，与对照组相比，接受 EVs - siBRAFV600E治疗的小鼠，其皮下肿瘤生长明显减缓，肿瘤体积和重量显著减小。免疫组化和 Western blotting 分析表明，EVs - siBRAFV600E治疗组的肿瘤组织中，BRAF 表达和 ERK1/2 磷酸化水平降低。在肺转移和肝转移模型中，EVs - siBRAFV600E处理后的小鼠，肺和肝转移灶明显小于对照组。这说明 EVs - siBRAFV600E在体内能有效抑制 BRAFV600E CRC 的生长和转移，并降低肿瘤组织中 BRAF - MEK1/2 - ERK1/2 信号通路的活性。
为了更贴近临床实际情况，研究人员利用患者来源的 BRAFV600E突变的 CRC 组织，构建了 PDX 模型。实验结果显示，EVs - siBRAFV600E治疗组的肿瘤生长速度明显慢于对照组，肿瘤体积和重量显著减小。免疫组化分析表明，EVs - siBRAFV600E治疗组的肿瘤组织中，BRAF 表达和 ERK1/2 磷酸化水平较低。而在 BRAF 野生型的 PDX 模型中，EVs - siBRAFV600E对肿瘤生长没有明显影响。这进一步证明了 EVs - siBRAFV600E对 BRAFV600E突变的 CRC 具有特异性治疗效果，对 BRAF 野生型 CRC 则无显著疗效。
研究人员还对治疗药物的靶向能力和全身毒性进行了评估。通过构建 PDX 模型并注射 DiD 标记的细胞外囊泡，发现 EVs - siBRAFV600E和对照组的细胞外囊泡都能在肿瘤部位积累，表明 EVs - siBRAFV600E具有靶向肿瘤部位的能力。对重要器官功能指标和组织学分析显示，接受 EVs - siBRAFV600E治疗的小鼠，其重要器官功能指标正常，肺、肝、肾和脾组织的结构和形态也未发生明显变化。这说明 EVs - siBRAFV600E在治疗 CRC 时，不会对重要器官产生明显的毒副作用。
在本次研究中，研究人员构建了一种基于 EVs 和核酸药物的治疗系统，用于治疗 BRAFV600E突变的结直肠癌。实验表明，该治疗系统中的 EVs - siBRAFV600E能够特异性地降低 BRAFV600E CRC 细胞中的 BRAF 水平，抑制 MEK1/2 和 ERK1/2 的激活，从而有效抑制 BRAFV600E CRC 细胞的生长和转移。通过多种动物模型的实验，进一步验证了 EVs - siBRAFV600E在体内的治疗效果，且该治疗系统具有良好的靶向性和安全性。
这一研究成果意义重大，为 BRAFV600E突变的 CRC 患者提供了一种新的治疗策略，有望改善这类患者的预后。同时，也为其他携带 BRAFV600E突变肿瘤的治疗提供了参考，推动了肿瘤靶向治疗和个性化精准治疗的发展。不过，目前基于 EVs 的治疗方法在临床应用中还面临一些挑战，如难以大量提取高纯度的 EVs，EVs 可能引发免疫排斥反应等。但这些挑战也为后续研究指明了方向，相信随着研究的不断深入，这些问题将逐步得到解决，为癌症患者带来更多的希望。
