基于Lectin-PAINT超分辨成像技术的细胞糖基化指纹图谱解析新方法

本研究针对糖基化研究中的灵敏度、多重检测和原位变异捕获难题，开发了"Lectin-PAINT"超分辨成像技术。通过8色荧光标记的植物凝集素库，实现了活细胞表面糖萼的单分子水平可视化，可同时获取350余个糖基化参数，成功构建了癌症细胞的"糖型"指纹图谱，为疾病相关糖基化研究提供了全新工具。

　　

细胞表面的糖萼是由糖蛋白和糖脂构成的复杂网状结构，就像细胞的"分子身份证"，在细胞通讯、免疫应答等过程中扮演关键角色。然而这个"糖密码"的破译却面临巨大挑战——糖链合成没有DNA模板指导，存在惊人的结构多样性；现有质谱技术会破坏细胞结构，而传统显微技术又难以突破衍射极限。更棘手的是，糖链结合蛋白（凝集素）往往具有低亲和力和多价结合特性，使得活细胞成像尤为困难。这些技术瓶颈严重阻碍了人们对糖基化在癌症等疾病中作用机制的理解。

荷兰埃因霍温理工大学（Eindhoven University of Technology）的Lorenzo Albertazzi团队在《Communications Biology》发表创新成果，开发出名为"Lectin-PAINT"的革命性成像技术。该方法巧妙利用凝集素可逆结合的特性，结合点累积纳米级拓扑成像（PAINT）原理，首次实现了活细胞表面糖基化的超分辨、多参数定量分析。研究人员构建了包含8种植物凝集素的探针库，覆盖唾液酸（NeuAc）、岩藻糖（Fuc）等关键糖类识别，通过微流控系统实现8色循环成像，从单细胞中提取出352个糖基化特征参数。

关键技术包括：（1）优化凝集素-荧光染料偶联策略，确保结合动力学不受干扰；（2）开发三种细胞固定方案（固定贴壁、活体贴壁和活体捕获）适应不同研究需求；（3）建立自动化的微流控8色成像平台；（4）开发单粒子追踪（SPT）算法提取扩散系数、结合停留时间等44类参数；（5）采用主成分分析（PCA）进行多维数据降维和细胞分类。

【Methodology and lectin library】

研究团队精选8种植物凝集素构建探针库，包括识别α2,3/α2,6唾液酸（SNA/MAL）、岩藻糖（AAL/LTL）等关键糖链结构的探针。通过将凝集素与ATTO532/643荧光染料偶联，利用其亚微摩尔级亲和力实现PAINT成像所需的瞬态结合特性。每个结合事件可同时获取糖链的空间分布、运动轨迹和结合动力学三类信息。

【Cell-capture and Lectin-PAINT proof of concept】

开发三种成像模式：固定细胞可获得10nm级空间分辨率，活细胞成像则能追踪糖链动态行为。其中创新的抗体捕获法使悬浮细胞（如白血病细胞）也能进行全膜区TIRF成像。实验证明WGA探针在三种模式下均能有效标记N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），固定细胞显示均匀分布，而活细胞中观察到糖蛋白的二维扩散。

【Automated Glycotyping of leukaemia cells】

应用该技术对三种急性髓系白血病（AML）细胞系（HL-60、Kasumi-1和KG-1）进行糖型分析。PCA分析显示三类细胞在糖基化特征空间显著分离，其中HL-60与Kasumi-1虽同属FAB-M2型但呈现明显差异，而存在分类争议的KG-1细胞显示出独特的糖型特征。特别发现 confinement ratio（限制比）等动态参数对细胞分类贡献显著。

研究证实糖基化存在惊人的细胞间异质性，如A431细胞高表达与转移相关的α2,3唾液酸，而CHO-Lec2细胞则几乎不表达。值得注意的是，唾液酸缺陷型细胞（CHO-Lec2）中半乳糖（Gal）表达显著升高，印证了糖链合成的补偿机制。与质谱和流式结果对比显示，Lectin-PAINT能特异性检测膜表面可及糖链，提供传统技术无法获取的分子运动信息。

这项研究开创了糖生物学研究的新范式，其重要意义体现在：（1）首次实现活细胞糖基化的多参数超分辨成像，将糖型分析推进到单分子水平；（2）揭示糖链动态行为与细胞类型的关联性，为癌症分型提供新维度；（3）建立的技术框架可扩展至其他低亲和力相互作用研究；（4）微流控-自动化平台设计使临床样本高通量分析成为可能。未来该技术有望在免疫治疗靶点发现、肿瘤液体活检等领域发挥重要作用，推动"糖组学"进入单细胞时代。