《Nature Chemistry》：Site-specific activation of the proton pump inhibitor rabeprazole by tetrathiolate zinc centres
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为解决质子泵抑制剂（PPIs）在非酸性环境中的激活机制及潜在靶蛋白问题，研究人员开展相关研究。结果发现锌促进 PPIs 在非酸性环境下的激活与结合。这一成果有助于理解 PPIs 副作用，为开发更安全药物提供思路，值得科研读者一读。
在医学的大舞台上，质子泵抑制剂（PPIs）可是当之无愧的 “明星药物”。它被世界卫生组织列入基本药物清单，是全球使用最为广泛的药物之一。PPIs 就像胃酸的 “克星”，能有效抑制胃酸分泌，对治疗消化性溃疡和胃食管反流等疾病效果显著。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了六种 PPIs 变体，像奥美拉唑、埃索美拉唑、兰索拉唑、右兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑，它们虽然 “长相” 略有不同，但都有着相同的化学骨架。
不过，PPIs 虽然厉害，却也藏着不少秘密。一直以来，人们都知道 PPIs 是前药，需要在酸性环境中质子化才能被激活，进而抑制胃酸分泌。可一旦进入血液循环，PPIs 就有可能到达身体各个组织。这就引发了一系列疑问：在非酸性环境中，PPIs 能不能被激活呢？如果能，激活机制是什么？它们会不会还有其他的蛋白质靶点，从而在身体的其他部位产生影响呢？而且，长期使用 PPIs 会增加心血管并发症和肾脏疾病的风险，这些副作用是不是和 PPIs 在非酸性环境中的激活有关呢？为了揭开这些谜团，作者[第一作者单位] 的研究人员踏上了探索之旅。
终于，他们的努力有了成果，在《Nature Chemistry》期刊上发表了题为 “Zinc promotes covalent conjugation of proton pump inhibitors to proteins in non - acidic environments” 的论文。研究人员发现，锌离子在非酸性环境中能够促进 PPIs 的激活和结合，这一发现就像一把钥匙，打开了 PPIs 作用机制研究的新大门，为理解 PPIs 的副作用以及开发更安全有效的药物奠定了基础。
在这场探索之旅中，研究人员运用了多种技术方法。他们首先采用了化学蛋白质组学方法，通过合成带有叠氮基团的雷贝拉唑类似物，利用无铜点击化学技术，来识别与雷贝拉唑形成共价键的蛋白质。接着，为了探究锌离子在雷贝拉唑与蛋白质结合过程中的作用，他们进行了细胞实验和体外实验。在细胞实验中，通过表达不同的 DENR 突变体，观察雷贝拉唑的结合情况；体外实验则利用重组表达的 DENR 蛋白，研究锌离子对雷贝拉唑结合的影响。此外，他们还运用了质谱技术，包括完整蛋白质质谱、液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）等，来鉴定雷贝拉唑的结合位点和蛋白质的修饰情况。最后，借助核磁共振光谱（NMR）和分子动力学模拟（MD），研究雷贝拉唑与 DENR 的相互作用以及蛋白质的结构变化。
下面，让我们来详细看看他们的研究成果。
鉴定雷贝拉唑的靶蛋白
为了找到与雷贝拉唑形成共价加合物的蛋白质，研究人员合成了一种雷贝拉唑类似物（雷贝拉唑叠氮，Rabazi） 。他们把 Rabazi 与 HEK293 MSR 细胞一起孵育，之后运用无铜点击化学技术，将蛋白质 - Rabazi 结合物与荧光染料 Cy5 或者琼脂糖珠相连。结果发现，Rabazi 能与多种蛋白质结合，而且结合情况不受细胞外 pH 值的影响，这表明 Rabazi 在细胞内就能被激活。通过质谱分析，研究人员鉴定出了与 Rabazi 结合的蛋白质，令人惊讶的是，锌结合蛋白在这些蛋白质中高度富集。为了验证这一发现的普遍性，研究人员又在人胰腺导管腺癌细胞系 PACO17 中进行了同样的实验，得到了相似的结果。在众多与雷贝拉唑结合的蛋白中，密度调节重新起始和释放因子（DENR）引起了研究人员的注意，它在两种细胞系中都能与雷贝拉唑高效结合，于是被选为进一步研究的对象。
细胞内雷贝拉唑结合依赖于 Zn2?结合
研究人员在 HEK293 MSR 细胞中异位表达了带有标签的 DENR 蛋白，然后用 Rabazi 处理细胞。经过一系列实验操作，他们发现 Rabazi 能与 DENR 形成二硫键结合物。为了确定 DENR 中与 Rabazi 结合的关键位点，研究人员构建了多种突变体。当把参与锌配位的半胱氨酸（C34、C37、C44 和 C53）替换为丙氨酸时，Rabazi 的结合明显减弱。有趣的是，把 C53 替换为组氨酸后，Rabazi 与 DENR 的结合能力并没有受到太大影响，而替换 C44 则会使结合能力丧失。这说明 DENR 与锌离子的稳定结合是 Rabazi 与 DENR 结合的前提，而且 C53 在维持锌离子结合方面有特殊作用。
Rabazi 与重组 DENR 的结合依赖于锌结合
在体外实验中，研究人员在大肠杆菌中重组表达了带有 His 标签的人野生型 DENR 蛋白，并与它的天然结合伙伴 MCTS1 共表达，纯化得到了重组的 His - DENR - MCTS1 复合物。实验发现，添加硫醇反应性烷基化剂 NEM 能增强 Rabazi 与重组 DENR 结合的检测信号。去除锌离子后，Rabazi 与重组 DENR 的结合受到抑制，这再次证明了锌离子在结合过程中的重要性。而且，突变 DENR 中不同的锌配位半胱氨酸，结合情况也会发生变化，与细胞内实验结果相互印证。
C4 锌簇倾向于解离一个配体
为了深入了解 DENR 锌结合位点在硫醇修饰剂存在下的动态变化，研究人员进行了完整蛋白质质谱分析。他们用过量的 NEM 处理野生型 DENR，发现大部分蛋白质与三个 NEM 分子结合，但也有一小部分与四个 NEM 分子结合，这意味着锌簇中的一个半胱氨酸配体发生了解离。由此，研究人员推测了雷贝拉唑与蛋白质结合的过程：锌簇中的一个半胱氨酸配体（可能是 C53）解离后，雷贝拉唑的苯并咪唑氮原子可以占据这个空位，进而与锌离子结合。
雷贝拉唑与锌配位半胱氨酸 44 和 34 结合
通过完整蛋白质质谱和 LC - MS/MS 技术，研究人员确定了雷贝拉唑在 DENR 上的结合位点。他们发现雷贝拉唑主要与 C44 和 C34 结合，这一结果可以从锌簇中硫原子的相对可及性来解释。此外，研究人员还用差异烷基化方法进一步验证了这一结论，并且发现 C44 可能是雷贝拉唑共价结合的首选位点。
雷贝拉唑导致 DENR 发生重大构象变化
研究人员尝试结晶 DENR - MCTS1 - 雷贝拉唑复合物，但没有成功，将雷贝拉唑浸泡到 DENR - MCTS1 晶体中还导致晶体破裂，这表明雷贝拉唑结合会引起蛋白质结构的重大变化。于是，他们借助 NMR 光谱技术，在溶液中监测结构变化。实验发现，在 DENR 存在的情况下，雷贝拉唑的 1H 信号会快速消失，同时 DENR 的酰胺峰也出现了化学位移扰动，这说明雷贝拉唑与 DENR 发生了化学反应，导致蛋白质结构改变。分子动力学模拟实验也显示，雷贝拉唑与 DENR 之间存在疏水相互作用，这种作用促进了雷贝拉唑与锌簇的初始配位。
所有 PPI 变体都与 DENR C4 锌指反应
最后，研究人员想知道其他 PPIs 是否也有类似的性质。他们发现，用雷贝拉唑处理 DENR 会导致锌离子释放，而其他 FDA 批准的 PPIs 也能使 DENR 释放锌离子，尽管效率不如雷贝拉唑。这表明所有 PPIs 都能与 C4 锌指相互作用并发生反应。
综合这些研究结果，研究人员提出了 PPIs 在非酸性环境中的激活和结合机制。在 C4 锌结合位点，一个半胱氨酸配体在结合和解离状态之间快速平衡，暂时打开锌原子上的一个配位位点。PPIs 可以通过苯并咪唑氮原子与锌离子形成复合物，锌离子作为路易斯酸，促进 PPIs 的激活和结合。之后，经过一系列化学反应，PPIs 最终与半胱氨酸形成二硫键结合物。
这项研究意义重大。它首次揭示了 C4 锌指蛋白是雷贝拉唑以及可能是所有 PPIs 的激活剂和靶点，为理解 PPIs 在非酸性环境中的作用机制提供了新视角。这一发现也有助于解释长期使用 PPIs 产生副作用的原因，因为研究中发现的一些靶蛋白与炎症和免疫功能相关，这或许暗示着 PPIs 的副作用可能与这些非经典靶蛋白有关。而且，研究结果还为开发更安全有效的 PPIs 药物提供了理论基础，未来也许可以通过调节 PPIs 与锌结合蛋白的相互作用，减少副作用的发生。在医学研究的道路上，这项研究成果为进一步探索 PPIs 的奥秘点亮了一盏明灯，为人类健康事业的发展带来了新的希望。
